Slug蛋白、E-钙黏蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其与肺癌预后的关系*

岳银艳，吴秋歌，田文娴，周　璐，郭亚涛，黄亚辉，王　静

郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052



Slug蛋白、E-钙黏蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其与肺癌预后的关系*

岳银艳，吴秋歌，田文娴，周璐，郭亚涛，黄亚辉，王静#

郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052

关键词Slug蛋白；E-钙黏蛋白；非小细胞肺癌；无进展生存期

摘要目的：测定非小细胞肺癌组织中Slug蛋白、E-钙黏蛋白的表达水平，探讨二者与肺癌预后的关系。方法：采用免疫组化法检测68例非小细胞肺癌及30例癌旁组织中Slug蛋白、E-钙黏蛋白的表达情况。分析2种蛋白表达与临床病理特征及无进展生存期的关系。结果：非小细胞肺癌组织中Slug蛋白、E-钙黏蛋白的表达与癌旁组织中的表达相比差异有统计学意义(P<0.001)。Slug蛋白、E-钙黏蛋白的表达均与非小细胞肺癌的TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。非小细胞肺癌组织中Slug蛋白与E-钙黏蛋白的表达呈负相关(rS=-0.228，P=0.010)。Slug蛋白阳性表达的患者无进展生存期为11个月，阴性表达的患者为17个月，差异有统计学意义(P=0.036)；E-钙黏蛋白阳性表达的患者无进展生存期为13个月，阴性表达的患者为11个月，差异具有统计学意义(P=0.003)。结论：Slug蛋白、E-钙黏蛋白在非小细胞肺癌的进展过程中起重要作用，两者可能存在相互作用，且与患者无进展生存期密切相关，可作为判断非小细胞肺癌预后的标志物。

AbstractAim: To investigate the expressions of Slug and E-cadherin and the relationship with the prognosis in non-small-cell lung cancer(NSCLC). Methods: The expressions of Slug and E-cadherin in 68 specimens of NSCLC and 30 specimens of adjacent normal tissue were detected by immunohistochemistry. The relationship among the two kinds of protein expression and clinical pathological parameters and progression free survival(PFS) were analyzed. Results: There were significant difference in the expressions of the two proteins between the lung cancer tissue and adjacent normal tissue(P<0.001). The expressions of Slug and E-cadherin proteins were closely related with TNM stages and lymph node metastasis(P<0.05). The expression of Slug was negatively correlated with that of E-cadherin(rS=-0.228，P=0.010). The PFS of patients with positive expression of Slug protein was 11 months, while patients with negative expression was 17 months. and the difference was significant(P=0.036). The PFS of patients with positive expression of E-cadherin protein was 13 months, while patients with negative expression was 11 months,and the difference was significant(P=0.003). Conclusion: Slug and E-cadherin play important roles in the development of NSCLC, which are closely related with the PFS of NSCLC patients. They might be used as biomarkers in judging the prognosis of NSCLC.

目前，肺癌是世界上引起死亡人数最多的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的85%[1]。肺癌的转移特性与其预后密切相关。肺癌的转移是一个极其复杂的、由多种基因调控的多阶段、多步骤过程。其中，上皮细胞-间叶细胞转型(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)在恶性肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用，而细胞间的黏附性降低是极其重要的一个步骤。上皮E-钙黏蛋白(E-cadherin，EC)可抑制肿瘤的转移，其表达下降或缺失可促进肿瘤细胞的转移[2]。锌指转录因子Slug蛋白是Snail锌指转录因子家族成员，可以通过与EC启动子区域的E-boxes结合而抑制EC的表达[3]。作者采用免疫组化SP方法检测了68例NSCLC标本及30例癌旁组织标本中Slug蛋白和EC表达情况，探讨这2种蛋白表达与NSCLC临床病理特征及预后的关系。

1材料与方法

1.1材料收集2011年1月至2013年4月郑州大学第一附属医院胸外科手术切除的NSCLC标本68例，患者术前均未行放疗及化疗。所有肺癌组织标本均以体积分数10%甲醛固定，石蜡包埋，经苏木精-伊红染色病理学确诊。68例患者中，男51例，女17例；年龄39～77(59.76±8.60)岁；病理类型包括鳞癌30例，腺癌38例；有淋巴结转移者28例，无淋巴结转移者40例；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期51例，Ⅲ期17例。另取其他NSCLC患者的癌旁组织30例作为对照。所有患者术后分别正规化疗4周期，化疗方案分别为吉西他滨+奥沙利铂、多西他赛+奈达铂、培美曲赛+奈达铂、吉西他滨+奈达铂、多西他赛+顺铂；均未行生物治疗及靶向治疗。

1.2Slug和EC蛋白的免疫组化SP法检测石蜡标本5 μm厚连续切片，实验步骤严格按照说明书进行。Slug、EC兔抗人单克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司(均按1300稀释)，二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，每批实验均以北京博奥森公司提供的阳性对照片做阳性对照，以PBS代替一抗做阴性对照。最后以DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，于显微镜下观察染色情况。Slug蛋白阳性染色为细胞核或细胞质内出现棕黄色颗粒；EC蛋白阳性染色为细胞膜和细胞质内出现棕黄色颗粒，部分间质、炎细胞及血管上皮细胞上也可见蛋白染色。参照贺荣芳等[4]描述的分级方法，每例切片选取5个高倍视野进行结果判定。根据细胞被染色强度及染色细胞所占百分比之积来判断结果。染色强度可分为4级：0分为未见阳性细胞，1分为弱阳性，2分为中等阳性，3分为为强阳性。阳性染色细胞所占百分比可分为5级：0分为无阳性细胞，1分为<10%，2分为10%～，3分为50%～，4分为>80%。其中染色强度与染色细胞所占百分比之积≥3分为阳性，<3为阴性，对相关资料进行定量积分并计算阳性表达率[5]。

1.3统计学处理采用SPSS 15.0进行分析，应用χ2检验比较NSCLC组织及癌旁组织中Slug和EC蛋白表达的差异，并分析其与NSCLC患者各临床病理特征之间的关系，应用Spearman等级相关分析NSCLC组织中Slug和EC蛋白表达的相关性，应用Kaplan-Meier法对NSCLC患者进行单因素生存分析，检验水准α=0.05。

2结果

A：腺癌组织；B：鳞癌组织；C：癌旁组织。1：Slug蛋白；2：EC蛋白。 图1　肺腺癌、鳞癌和癌旁组织中Slug、EC蛋白的表达(SP，×400)

2.1NSCLC组织及癌旁组织中Slug和EC蛋白的表达Slug蛋白阳性表达主要位于细胞核和细胞浆，呈棕黄色(图1上排)。EC蛋白阳性表达主要位于细胞膜和细胞浆，呈棕黄色(图1下排)；在NSCLC癌组织及癌旁组织， Slug蛋白的阳性表达率分别为67.6%(46/68)和13.3%(4/30)，差异有统计学意义(χ2=24.573，P<0.001)；EC蛋白的阳性表达率分别为50.0%(34/68)和90%(27/30)，差异有统计学意义(χ2=14.172，P<0.001)。

2.2NSCLC组织中Slug和EC蛋白的表达与临床病理特征的关系见表1。

表1　Slug和EC蛋白表达与NSCLC临床病理特征的关系

2.3NSCLC组织中Slug和EC蛋白表达的相关性分析Spearman等级相关分析结果显示，NSCLC组织中Slug与EC蛋白的表达之间呈负相关(rS=-0.228，P=0.010)。

2.4Slug和EC蛋白表达与无进展生存期(progression-free survival,PFS)的关系见图2。Slug蛋白阳性与阴性表达的中值PFS分别为11和17个月，2组的PFS曲线比较差异有统计学意义(χ2=4.418，P=0.036)；EC蛋白阳性与阴性表达的中值PFS分别为13和11个月，2组的PFS曲线比较差异有统计学意义(χ2=9.064，P=0.003)。

图2　Slug蛋白(上)和EC蛋白(下)表达与NSCLC患者PFS的关系

3讨论

EMT是胚胎正常发育的一个关键步骤，对于原肠胚的发生发育、心脏的形成、神经脊的形成等发挥了重要作用[6]。研究[7]表明EMT可增加细胞侵袭和转移能力，在肿瘤发生发展中起了极其重要的作用。通过上皮间质转化，肿瘤细胞获得间质细胞的特征，从而变得更有活动性和侵袭性[8]。EMT的主要特点之一是上皮细胞表达的位于其细胞膜的黏附分子——EC表达的下调。EC是钙黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亚型的一种，是经典的转移抑制因子，对调节细胞黏附具有重要作用[9]。EC低表达或缺失可使肿瘤细胞丧失接触抑制，导致细胞无限制增殖，失去分化，极易发生浸润和转移[10]。该研究结果显示，在30例癌旁组织中，EC主要位于细胞膜上，表达率为90%，而在肿瘤组织中EC的表达率降低，为50%，且其表达率随着NSCLC的分期增加而减少，有淋巴结转移组表达率低于无淋巴结转移组。其中，EC阳性表达患者的PFS较阴性表达患者长，提示EC的阴性表达可能与肿瘤的转移及预后密切相关。

EC的表达下调主要通过EC转录抑制子与其启动子的结合而实现[11]。E-钙黏附转录抑制子包括Zeb家族、Snail1、Slug蛋白、Twist等[12]。其中Slug蛋白能识别通用的E2-盒元件以抑制靶基因EC的转录。有研究[13]发现，在人乳腺癌细胞系中敲除Slug基因后可以完全阻断Twist1对EC的转录抑制作用，证实Slug蛋白对EC转录的抑制作用。该研究结果显示，肿瘤组织中Slug蛋白的表达高于癌旁组织，有淋巴结转移组明显高于无转移组，Ⅲ期组高于Ⅰ-Ⅱ组，提示Slug蛋白的高表达与肿瘤的发生、浸润、转移密切相关。

目前，对Slug和EC蛋白在NSCLC的浸润及转移之间关系的研究较少，尤其相关的体内实验研究更加少见。Fernando等[14]发现在黑色素瘤细胞间质转化过程中，转录因子Slug蛋白可抑制EC的表达，导致肿瘤细胞EMT的发生。Slug蛋白的表达增加和EC的细胞膜表达量减少可能降低肿瘤细胞间的黏附力，使肿瘤细胞失去上皮细胞极性，导致肿瘤细胞的上皮间质转化，使肿瘤细胞更容易浸润和转移；并且通过Slug和EC蛋白两者之间的相互作用，更有助于肿瘤细胞的浸润和转移，与肿瘤的预后密切相关[15-16]。该研究中，Slug蛋白的表达在肺癌组织中高于癌旁组织，与EC蛋白的表达呈负相关，说明Slug蛋白高表达与肺癌发生、转移相关，与Fernando等[14]研究结果相符。

研究肺癌的预后，可以较为客观地评价其临床治疗效果，并权衡其治疗方法是否恰当。因此，探索肺癌的相关预后指标对于完善多学科综合治疗方案，提高治疗效果具有重要意义。作者发现，影响NSCLC患者生存时间的因素包括Slug蛋白表达、EC蛋白表达、分期和转移情况，而与患者性别、年龄、病理分型无关。由此可推测，Slug、EC蛋白的联合检测将有利于临床上预测患者的预后，并有可能成为判断肺癌预后的新指标。

参考文献

[1]SIEGEL R,NAISHADHAM D,JEMAL A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11

[2]DAVID JM,RAJASEKARAN AK.Dishonorable discharge: the oncogenic roles of cleaved E-cadherin fragments[J].Cancer Res,2012,72(12):2917

[3]TOIYAMA Y,YASUDA H,SAIGUSA S,et al.Increased expression of Slug and Vimentin as novel predictive biomarkers for lymph node metastasis and poor prognosis in colorectal cancer[J].Carcinogenesis,2013,34(11):2548

[4]贺荣芳,胡忠良,沈明,等.胃癌组织中PTEN,VEGF,MMP-9的表达及相关性研究[J].中国普通外科杂志,2005,14(3):173

[5]许良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志,1996,6(4):229

[6]NIETO MA.The ins and outs of the epithelial to mesenchymal transition in health and disease[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2011,27:347

[7]张登勇,马翔,吴斌全,等.敲低MSX2对胰腺癌PANC-1细胞上皮-间充质转化的影响[J].南方医科大学学报,2015,32(2):179

[8]CASTRO ALVES C,ROSIVATZ E,SCHOTT C,et al.Slug is overexpressed in gastric carcinomas and may act synergistically with SIP1 and Snail in the down-regulation of E-cadherin[J].J Pathol,2007,211(5):507

[9]ROY F,BERX G.The cell-cell adhesion molecule E-cadherin[J]. Cell Mol Life Sc,2008,65(23):3756

[10]RACHAGANI S,SENAPATI S,CHAKRABORTY S,et al.Activated KrasG12D is associated with invasion and metastasis of pancreatic cancer cells through inhibition of E-cadherin[J].Br J Cancer,2011,104(6):1038

[11]赵阳,许峰,任宏,等.E-cadherin基因启动子C-160A SNP与胃癌的相关性[J].西安交通大学学报(医学版),2013,2(2):214

[12]刘志娴,魏尔清,卢韵碧.上皮-间质转化在肿瘤发生发展中的作用研究进展[J].浙江大学学报(医学版),2015,44(2):211

[14]FERNANDO RI,LITZINGER M,TRONO P,et al.The T-box transcription factor Brachyury promotes epithelial-mesenchymal transition in human tumor cells[J].J Clin Invest,2010,120(2):533

[15]TANAKA Y,TERAI Y,KAWAGUCHI H,et al.Prognostic impact of EMT(epithelial-mesenchymal-transition)-related protein expression in endometrial cancer[J].Cancer Biol Ther,2013,14(1):13

[16]UCHIKADO Y,NATSUGOE S,OKUMURA H,et al.Slug expression in the E-cadherin preserved tumors is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2005,11(3):1174

(2015-06-02收稿责任编辑赵秋民)

*河南省科技攻关计划项目142300410032

Expressions of Slug and E-cadherin in non-small cell lung cancer tissue and its relationship with prognosis

YUEYinyan，WUQiuge，TIANWenxian，ZHOULu，GUOYatao，HUANGYahui，WANGJing

DepartmentofRespiratoryDiseases，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordsSlug; E-cadherin; non-small-cell lung cancer; progression free survival

中图分类号R734.2

通信作者#，女，1958年11月生，博士，教授，研究方向：肺癌的发病机制和早期预警，E-mail：wangjing@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.009