胃癌患者癌组织膜联蛋白A2的表达与血清膜联蛋白A2及癌胚抗原水平测定*

张志栋，李　勇，檀碧波，赵　群，焦志凯，赵雪峰，王　冬，刘　羽

河北医科大学第四医院外三科 石家庄 050011



胃癌患者癌组织膜联蛋白A2的表达与血清膜联蛋白A2及癌胚抗原水平测定*

张志栋，李勇#，檀碧波，赵群，焦志凯，赵雪峰，王冬，刘羽

河北医科大学第四医院外三科 石家庄 050011

关键词胃肿瘤;膜联蛋白A2;癌胚抗原

摘要目的：检测胃癌患者癌组织中膜联蛋白A2(ANXA2)的表达和血清ANXA2及癌胚抗原(CEA)水平，并分析其临床意义。方法：选取胃癌患者65例(淋巴结阴性16例、淋巴结阳性不伴远处转移40例、淋巴结阳性伴远处转移9例)为观察组，同时选取50名健康体检者为对照组。采用免疫组化SP法检测观察组患者癌及癌旁组织中ANXA2的表达。取观察组患者术前1 d、术后1个月及对照组血清，采用ELISA法检测ANXA2水平，采用电化学发光法检测血清CEA水平。结果：观察组患者癌组织中ANXA2的阳性表达率高于癌旁组织(P<0.001)；淋巴结阳性不伴远处转移者、淋巴结阳性伴远处转移者癌组织中ANXA2的阳性表达率高于淋巴结阴性者(P<0.017)。观察组术前血清ANXA2、CEA水平高于对照组，观察组中淋巴结阳性伴远处转移者血清CEA水平最高(P<0.05)；术后1个月观察组血清ANXA2、CEA水平较术前降低，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。观察组癌组织中ANXA2的阳性表达率与术前血清ANXA2水平呈正相关，术前血清ANXA2与CEA水平也呈正相关(rS=0.407和0.537，P均<0.001)。结论：联合检测血清ANXA2与CEA对胃癌的病情评估有重要意义。

AbstractAim: To test the expression of ANXA2 in gastric cancer tissue and ANXA2 and carcinoembryonic antigen(CEA) in serum from patients with gastric cancer.Methods: A total of 65 cases of gastric cancer were recruited as observation group(16 with negative lymph nodes, 40 with positive lymph nodes but without distant metastasis, 9 with positive lymph nodes and distant metastasis), and 50 normal healthy individuals, as control group.Immunohistochemical SP technique was performed to detect the expression of ANXA2 in gastric cancer and normal mucosa tissue.The serum of the observation group was prepared before and after operation, the level of ANXA2 was tested by ELISA, and the level of CEA was tested with electrochemiluminescence immunoassay.Results: The positive expression rate of ANXA2 was higher in gastric cancer tissue than that in normal mucosa tissue(P<0.001), and the expression of ANXA2 in the patients with positive lymph nodes and distant metastasis and the patients with positive lymph nodes but without distant metastasis was higher than that of patients with negative lymph nodes(P<0.017). The levels of preoperative ANXA2 and CEA in serum of observation group were higher than those of control group, and the highest serum CEA level was found in positive lymph nodes with distant metastasis patients(P<0.05). After operation, the levels of serum ANXA2 and CEA of observation group decreased significantly,which had no significant difference with control group(P>0.05). Positive correlation was found between the expression of ANXA2 in tumor tissue and serum level of ANXA2 in observation group(rS=0.407,P<0.001). Positive correlation was found between serum ANXA2 and CEA(rS=0.537,P<0.001).Conclusion: It′s of important significance by testing serum ANXA2 combined with CEA for evaluating the gastric cancer patients′ condition.

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，由于缺乏特异性症状，早期诊断者不足10%[1]。多数患者就诊时病变已属进展期，多伴有淋巴结转移甚至远处转移，综合治疗效果不理想，预后较差。目前已将肿瘤标志物用于胃癌的诊断和病情监测，如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、CA125、CA199等，但特异性、准确性都不能令人满意。为了更好地评估胃癌患者的严重程度、病情发展及预测肿瘤的复发，寻找新的肿瘤标志物意义重大。膜联蛋白A(annexins A，ANXA)家族是一类广泛存在于真核细胞的钙磷脂结合蛋白，作用广泛。ANXA2是其中的重要成员，参与人类细胞的生理活动，且与恶性肿瘤的发生发展关系密切。有研究[2-4]表明ANXA2与乳腺癌、肝癌、胆管癌等关系密切，且与肿瘤的大小、病情的严重程度、肿瘤的分化程度及转移有关。作者所在的课题组前期研究[5]也发现ANXA2与胃癌关系密切，但是ANXA2在胃癌患者血清中的水平及其意义尚不清楚。该研究通过检测胃癌患者血清及癌组织中ANXA2的表达情况以及血清中CEA水平，进一步探讨其临床意义，为胃癌发病机制及新型肿瘤标志物的探索提供依据。

1对象与方法

1.1研究对象选取2013年2月至2014年6月于河北医科大学第四医院行手术治疗的胃癌患者65例为观察组，其中淋巴结阴性16例、淋巴结阳性不伴远处转移40例、淋巴结阳性伴远处转移9例，均经术后病理证实；男35例，女30例，年龄28～66岁。同时选取性别、年龄匹配的健康体检者50人(男28人，女22人)为对照组，年龄27～66岁。所有入组者均知情同意。

1.2主要试剂及仪器ELISA试剂盒购自美国R﹠D公司。ANXA2兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。全自动电化学发光免疫分析仪(罗氏E601)，酶免之星全自动免疫分析仪(瑞士Hamilton公司产品)。

1.3不同组织中ANXA2蛋白表达的检测癌组织石蜡标本在连续4 μm切片后用于检测ANXA2的表达，并以来自手术或胃镜活检、证实为无癌及不典型增生组织的癌旁黏膜组织为对照。石蜡切片脱蜡水化后依免疫组化SP法染色试剂盒说明书进行操作。一抗按1400稀释。用已知阳性组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。根据阳性细胞百分比和染色强度综合评分，在高倍镜下选10个视野，无阳性细胞计0分，阳性细胞百分比<25%计1分，25%～计2分，51%～计3分，>75%计4分；未着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两种计分标准所得分值的乘积为0或1为阴性，≥2为阳性。

1.4血清ANXA2及CEA水平的检测观察组在术前1 d、术后1个月各采血1次，对照组采血1次。采用ELISA法检测ANXA2。室温静置30 min后，3 500 r/min离心15 min，分离血清。严格依据试剂盒说明书操作。100 μL血清样本或者标准品被分别添加到96孔板中，加入A试剂100 μL，37 ℃孵育60 min，再加入B试剂100 μL，37 ℃孵育30 min，然后加入底物溶液90 μL，37 ℃孵育25 min，最后每孔添加终止液50 μL，并读取450 nm 处的吸光度。板内、板间变异系数均<10%，全自动酶标仪读数。采用电化学发光法检测血清CEA水平。

1.5统计学处理采用SPSS 16.0处理数据。胃癌患者癌和癌旁组织ANXA2阳性表达率的比较采用配对χ2检验，不同病理阶段的胃癌组织间ANXA2阳性表达率的比较采用χ2检验；观察组手术前后和对照组血清ANXA2、CEA水平的比较采用两独立样本的t检验，不同病理阶段的胃癌患者血清ANXA2和CEA水平比较采用重复测量数据的方差分析；用Spearman秩相关系数分析观察组血清ANXA2水平和癌组织中ANXA2表达的关系以及血清ANXA2 水平和CEA水平的关系。检验水准α=0.05。

2结果

2.1胃癌与癌旁组织ANXA2的表达情况见图1、表1。不同胃癌组织中ANXA2的表达见表2。由表1、2可知，观察组癌组织中ANXA2阳性表达率为81.5%(53/65)，高于癌旁胃黏膜组织的阳性率[4.6%(3/65)]；淋巴结阳性不伴远处转移组、淋巴结阳性伴远处转移组癌组织中ANXA2的阳性表达率高于淋巴结阴性组。

图1　癌旁胃黏膜(A)和胃癌(B)组织中ANXA2的表达(SP，×400)

表1　胃癌与癌旁胃黏膜组织中ANXA2的表达　例

表2　不同胃癌组织中ANXA2的表达　例(%)

χ2=5.979，P=0.015；*：与淋巴结阴性组相比，P<0.017。

2.2各组血清ANXA2、CEA水平的比较见表3～5。由表3～5可知，观察组术前血清ANXA2及CEA水平高于对照组，观察组术后1个月血清ANXA2及CEA水平与对照组相比，差异无统计学意义。观察组中，淋巴结阳性伴远处转移者术前血清CEA水平最高。

表3　观察组手术前后和

表4　不同病理阶段的

F组间=3.141，P=0.050；F时间=272.558，P<0.001；F交互=2.790，P=0.069。

表5　不同病理阶段的

F组间=16.441，P<0.001；F时间=1 556.522，P<0.001；F交互=12.568，P<0.001。

2.3观察组术前血清ANXA2水平与癌组织中ANXA2阳性表达率及术前血清CEA水平的关系观察组术前血清ANXA2水平与癌组织中ANXA2的阳性表达率呈正相关(rS=0.407，P<0.001)；观察组术前血清ANXA2水平与术前CEA水平呈正相关(rS=0.537，P<0.001)。

3讨论

胃癌在我国常见的消化道恶性肿瘤中发病率、死亡率均居首位，严重危害国人健康[6]。由于目前胃癌肿瘤标志物用作胃癌诊断和病情监测的准确率不能令人满意，故寻找新的肿瘤标志物对胃癌病情评估及综合治疗意义重大[7]。ANXA2与包括胃癌在内的多种恶性肿瘤关系密切，但该指标能否作为胃癌标志物报道很少。ANXA2全长14 000 bp，编码339个氨基酸，定位于人染色体15q21-q22，由13个外显子和12个内含子组成。ANXA2广泛表达于内皮细胞、单核细胞、神经细胞等的胞核和胞质中，参与细胞的增殖、分化、凋亡等生命过程[8]，并与肿瘤关系密切。Yonglitthipagon等[4]的研究表明，ANXA2在胆管癌中的高表达是预后差的指标；Yang等[9]研究发现ANXA2表达增高是结直肠癌预后差的独立影响因素。Wang等[10]研究发现抑制ANXA2表达后，肝癌细胞的生长受到抑制，且可以提高肝癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性。该研究发现ANXA2在胃癌组织中的表达高于癌旁胃黏膜组织，与其他报道[11]一致。同时作者还发现，淋巴结阳性伴及不伴远处转移的患者癌组织中ANXA2的阳性表达率高于淋巴结阴性的患者，提示ANXA2对胃癌的恶化与转移可能有促进作用。

为探讨ANXA2作为胃癌标志物的可行性，作者同时应用ELISA技术检测了胃癌患者血清ANXA2的水平。结果显示胃癌患者术前血清ANXA2高于正常人，而手术切除肿瘤后ANXA2水平降至正常水平，说明血清ANXA2对反映体内肿瘤状态有意义。对胃癌患者的血清ANXA2深入分析还发现，淋巴结阳性伴远处转移组、淋巴结阳性不伴远处转移组及淋巴结阴性组血清ANXA2虽呈下降趋势，但差异无统计学意义(P=0.069)，应扩大样本量进一步验证。相关分析表明观察组血清ANXA2水平与癌组织中ANXA2的阳性表达率呈正相关，提示血清ANXA2检测可作为胃癌术前分期的参考指标。术后血清ANXA2明显降低，也证实ANXA2在血清的水平与体内肿瘤的状态有关，术后监测血清ANXA2可反映体内肿瘤复发转移情况。

CEA是目前最常用的胃癌标志物[12]，对胃癌复发转移监测有意义。该研究结果发现，血清CEA水平与ANXA2水平呈正相关，提示血清ANXA2和CEA检测可能对预测胃癌复发转移有协同作用。

总之，该研究发现，ANXA2在胃癌患者的血清和癌组织中均存在升高的现象且存在相关性；监测血清ANXA2和CEA水平对预测胃癌病情有重要意义。但该研究规模较小，未进行深入的机制分析，这些问题还需要进一步研究完善。

参考文献

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[2]ZHANG F,ZHANG HC,WANG ZY,et al.P-glycoprotein associates with Anxa2 and promotes invasion in multidrug resistant breast cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2014,87(2):292

[3]ZHAO P,ZHANG W,TANG J,et al.Annexin Ⅱ promotes invasion and migration of human hepatocellular carcinoma cells in vitro via its interaction with HAb18G/CD147[J].Cancer Sci,2010,101(2):387

[4]YONGLITTHIPAGON P,PAIROJKUL C,CHAMGRAMOL Y,et al.Up-regulation of annexin A2 in cholangiocarcinoma caused by opisthorchis viverrini and its implication as a prognostic marker[J].Int J Parasitol,2010,40(10):1203

[5]ZHANG ZD,LI Y,FAN Q,et al.Annexin A2 is implicated in multi-drug-resistance in gastric cancer through p38MAPK and AKT pathway[J].Neoplasma,2014,61(6):627

[6]张晶晶,范开席.胃癌组织中 Artemin蛋白的表达[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(6):766

[7]邓薇,张小田,高静,等.人再生基因蛋白Ⅳ和细胞角蛋白18在胃癌患者血清中的表达及临床意义[J].解放军医学杂志,2012,37(12):1142

[8]张朝霞,赵芯梅,吕超蓝,等.膜联蛋白A2在炎症性肠病肠粘膜中的表达及临床意义[J].南方医科大学学报,2012,32(11):1548

[9]YANG T,PENG H,WANG J,et al.Prognostic and diagnostic significance of annexin A2 in colorectal cancer[J].Colorectal Dis,2013,15(7):e373

[10]WANG C,GUO Y,WANG J,et al.Annexin A2 knockdown inhibits hepatoma cell growth and sensitizes hepatoma cells to 5-fluorouracil by regulating β-catenin and cyclin D1 expression[J].Mol Med Rep,2015,11(3):2147

[11]ZHANG Q,YE Z,YANG Q,et al.Upregulated expression of annexin Ⅱ is a prognostic marker for patients with gastric cancer[J].World J Surg Oncol,2012,10:103

[12]TIAN SB,YU JC,KANG WM,et al.Combined detection of CEA, CA 19-9, CA 242 and CA 50 in the diagnosis and prognosis of resectable gastric cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(15):6295

(2015-03-27收稿责任编辑徐春燕)

*河北省普通高校强势特色学科资助项目冀教高[2005]52;河北省卫生和计划生育委员会课题ZD20140442

Detection of expression of ANXA2 in gastric cancer tissue and serum ANXA2 and CEA levels

ZHANGZhidong，LIYong，TANBibo，ZHAOQun，JIAOZhikai，ZHAOXuefeng，WANGDong，LIUYu

TheThirdDepartmentofSurgery，theFourthAffiliatedHospital，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011

Key wordsgastric neoplasm;annexins A2;carcinoembryonic antigen

中图分类号R735.2

通信作者#，男，1958年10月生，博士，教授，主任医师，研究方向：消化道恶性肿瘤基础与临床，E-mail:liyonghbth@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.019