玻璃化冷冻人卵母细胞体外受精-胚胎移植9例临床分析▲

黄 华 伍玲园 唐秀法 陈自洪 孙燕萍 牛向丽

(广西壮族自治区人口和计划生育研究中心生殖医学科，南宁市 530021，E-mail：86168263@qq.com)

论著·临床研究

玻璃化冷冻人卵母细胞体外受精-胚胎移植9例临床分析▲

黄 华 伍玲园 唐秀法 陈自洪 孙燕萍 牛向丽

(广西壮族自治区人口和计划生育研究中心生殖医学科，南宁市 530021，E-mail：86168263@qq.com)

目的 探讨人卵母细胞玻璃化冷冻在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中的应用效果。方法 行IVF-ET治疗、因取卵日男方因素无法进行受精的患者9例，对其成熟卵子进行玻璃化冷冻保存，解冻后进行卵胞浆内显微授精(ICSI)，记录卵子复苏、受精、卵裂及移植后妊娠情况。结果 9例患者共解冻复苏58枚卵子，复苏率68.2%(58/85)；复苏后进行ICSI的成熟卵子中，受精40枚，形成胚胎34枚，受精率69.0%，卵裂率85.0%。7个移植周期共移植胚胎15枚，临床妊娠3例，临床妊娠率42.9%。结论 人卵母细胞玻璃化冷冻可以获得一定的临床妊娠率，在IVF-ET中可作为临床治疗的选择之一。

体外受精；胚胎移植；玻璃化冷冻；卵胞浆内精子显微注射；卵母细胞

卵母细胞冷冻保存是一种发展迅速的技术，具有重要的现实意义和社会价值，该技术的应用逐渐增多。我国实施“二孩”政策以后，卵母细胞冷冻应用前景更加广阔。细胞内产生冰晶是冷冻过程中造成卵子功能受损的主要原因之一。与胚胎、精子相比，卵子的表面积与体积比值小，这导致了卵子在慢冻过程中更加不易脱水，进而在细胞内更容易形成冰晶，损伤细胞内超微结构，这可对卵子的发育潜能产生不利影响，甚至导致卵子凋亡。玻璃化冷冻卵子技术是近年来辅助生殖领域的一项热门新技术，能有效地解决冷冻过程中产生冰晶的问题。该技术不需要程序冷冻仪，操作简单、迅捷、效率高，而且费用相对较低。其原理是在高浓度冷冻保护剂作用下将卵母细胞快速降温，使胞浆由液态变为极其黏稠的非结构的玻璃态而无任何形式的冰晶形成。在卵子解冻过程中也同样能完全不形成冰晶，从而减少低温冻融对细胞产生的损伤[1]。该技术将卵子保存在-196℃液氮中，最长可保存30年，且保持排卵时的正常状态[2]。玻璃化冷冻技术从1995年开始用于人卵子的冷冻保存，因其能更好地保持卵子的生理功能，并获得更好的妊娠结局，逐渐被广泛认可，近年来被越来越多生殖中心应用于临床[3]。2013年美国生育年会颁布的指导原则也表明，成熟卵子的冷冻已经不再局限于实验研究[4]。但是，目前国内外不同生殖中心采用的载体、保护剂及冷冻程序等不尽相同，世界范围内还没有统一标准的玻璃化冷冻方案，对保护剂和载体的选择及冷冻程序等仍未达成共识[5]。许多研究致力于改进卵子玻璃化冷冻条件，探讨在体外受精中最佳的玻璃化冷冻方法。随着临床中玻璃化冷冻技术的不断推广和逐步完善，卵母细胞玻璃化冷冻技术也发展迅速，与新鲜卵母细胞相比，玻璃化冷冻卵子的受精率、卵裂率和临床妊娠率无统计学差异[6]。在临床上，有小部分患者在体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo tranfer，IVF-ET)采卵日因男方因素无法获得精子，通过行卵子玻璃化冷冻有效地解决了这一问题，避免了卵子的浪费，给广大不孕不育患者带来了福音。近年来本生殖中心根据单位现有条件，借鉴国内外先进生殖中心的经验，应用人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻这一技术，取得了较好的临床结局。本文分析9例在取卵当日因为男方取精失败而行卵子玻璃化冷冻的患者的临床结局，探讨卵子玻璃化冷冻技术在IVF-ET应用的可行性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年3月至2015年6月在我中心行IVF-ET助孕治疗的患者9例，均在取卵当日无法获得男方精子，年龄23～36岁，平均31.8岁。在签署知情同意书后行成熟卵子玻璃化冷冻。

1.2 卵子冻融方法

1.2.1 卵子冷冻方法：采用日本加藤公司的玻璃化冷冻冷却盒和瑞典Vitrolife公司的卵子处理液G-mops-plus。其中，玻璃化冷冻冷却盒包括平衡液(equilibration solution，ES)和玻璃化溶液(vitrification solution，VS)。配备冻卵所用冷冻液滴前，以上液体需要提前30 min于25℃室温进行平衡。将G-mops-plus 2 ml加入3001培养皿中，用剥卵器将已脱颗粒的成熟卵子移入，漂洗去油。在3003培养皿的皿盖配置G-mops-plus及ES微滴待用，其中G-mops-plus微滴1个，ES液滴3个(ES1、ES2、ES3)，各约20 μl，G-mops-plus液滴与ES1、ES2尽量等大且成等边三角形排列。漂洗去油后的卵子首先移至3003皿盖的G-mops-plus液滴。1 min后将G-mops-plus与ES1连线，计时2 min，由于渗透压的不同，过程中可见卵子飘向G-mops-plus液滴顶端；在G-mops-plus与ES1连线的中点与ES2再次连线，计时2 min；最后将卵子移至ES3液滴放置5 min。卵子置于ES3液滴期间，在3003皿盖继续配置VS液滴3个，每个约10 μl，反复用VS液清洗剥蚀的吸管。5 min后将卵子从ES3中移至VS液滴，依次漂洗数次，至最后一个VS液滴停留，准备装载，在VS液中的总时间需大于90 s但小于120 s。装载体积小于2 μl。装载后将载体投入盛有液氮的容器，再次核对标识后移入液氮罐。

1.2.2 解冻卵子：采用日本KITAZATO公司的玻璃化冷冻解冻试剂盒，解冻液由解冻液(thawing solution，TS)、稀释液(dilute solution，DS)和洗液-1(washing solution-1，WS-1)及WS-2 4部分组成。在使用前，也需要提前30 min将TS于37℃进行平衡，DS、WS-1和WS-2于25℃室温平衡。首先，从液氮中取出Cryotop载杆，将装有卵子的载杆前端快速浸入TS中，把卵子从 Cryotop 载杆上洗脱，此过程不超过1 min。然后，将卵子迅速移至DS中，让卵子自然下沉。3 min后再将卵子置于WS-1中，5 min后将卵子移至WS-2中。再过5 min后，将形态完全恢复的卵子转入培养液中。对复苏的成熟卵子全部进行卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)。

2 结 果

解冻了9例患者共85枚玻璃化冷冻成熟卵子，复苏了58枚，复苏率68.2%；对复苏的58枚MⅡ期卵子全部进行ICSI，共受精40枚，受精率69.0%(40/58)，形成了胚胎34枚，卵裂率85.0%(34/40)，优胚率32.3%(11/34)。7个移植周期移植胚胎15枚。移植后2周，抽血验β-HCG，2周后对阳性者行B超检测，有孕囊和出现胎心搏动者可判断为临床妊娠，临床妊娠共3例(42.9%)，其中1例为宫外孕，1例单胎足月分娩一健康男婴，另1例单胎仍在妊娠中，已有38周，发育正常。剩余3枚冷冻胚胎。9例患者的冻融结果及妊娠情况见表1。

表1 9例患者的冻融结果及妊娠情况

3 讨 论

玻璃化冷冻法利用高浓度保护剂溶液，使胚胎受冻时胞浆能从液态变为无结构的玻璃状态，这种玻璃状态能使处于溶液状态的分子和离子得以保持很好的分布，不产生细胞内结晶，不需充分脱水，渗透压与跨膜物质浓度相差不大，不易产生不可逆的细胞膜理化损伤而引起细胞死亡[7]，冷冻过程中细胞内容易形成冰晶，从而使细胞膜及细胞内结构受损，导致染色体异常，对细胞造成致命伤害，而玻璃化冷冻法很好地解决了这一问题[8]。玻璃化冷冻技术是体外受精实验室一个很好的工具，使辅助生殖有了更多的选择并增加了灵活性。玻璃化冷冻的出现推动了常规临床实践的期望结局的发展，无论是在提高解冻后的存活率、临床妊娠率，还是加强对植入前遗传学诊断的临床效果，此技术都有不俗的表现[9]。

人类卵母细胞体外保存已经成为辅助生殖技术进步的客观要求。作为一种发展迅速的冷冻技术，玻璃化冷冻技术的优点正逐渐被认识[5]。虽然，玻璃化冷冻卵母细胞解冻后的复苏率、受精率及移植妊娠率等都较前有所提高，但是，目前的卵子玻璃化冷冻技术还不够成熟，人们对冷冻卵子的成熟阶段、冷冻程序、冷冻剂等方面仍未全面了解[1]。虽然经过冷冻和解冻程序之后卵母细胞存活率似乎有所改善，但一个重要问题是体外成熟(in vitro maturation，IVM)与受精率低及未成熟的卵母细胞冷冻紧密相关[10]。然而，也有研究表明在未成熟GV期和在成熟MⅡ期玻璃化冷冻卵母细胞的存活率没有显著差异[11]。李娜等[12]选取未成熟卵子进行研究，将GV期卵子(220枚)直接行玻璃化冷冻，同时将GV期卵子(155枚)直接行IVM，待培养至MⅡ期，再行玻璃化冷冻，两组间存活率、成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率无差异，说明GV期卵子直接冷冻或体外培养至 MⅡ期冷冻效果相当。

本实验室采用的是美国玻璃化冷冻方法，冷冻试剂是日本KITAZATO公司的玻璃化冷冻解冻试剂盒和瑞典Vitrolife公司的G-mops-plus，9例患者共解冻复苏了85枚卵子，复苏率68.2%，高于秦文松等[13]报告的59.62%，与耿洁等[14]报告的68.57%相似，但低于滕晓明等[8]报告的83.02%；复苏后的成熟卵子进行ICSI，受精率69.0%，与秦文松等[13]报告的67.74%、滕晓明等[8]报告的72.73%相似，低于耿洁等[14]的91.67%； 卵裂率85.0%，与耿洁等[14]报告的86.36%相似，但低于秦文松等[13]报告的95.24%、滕晓明等[8]报告的93.75%； 7个移植周期共移植胚胎15枚，临床妊娠3例，获得了42.9%的移植妊娠率，与秦文松等[13]、耿洁等[14]报告的40%相似，高于滕晓明等[8]报告的22.22%。虽然ICSI 辅助受精能够大大提高冻融卵子的受精率，但是并不能提高卵裂率及优质胚胎率，后两者决定于精子与卵子的质量[15]。我们只获得了68.2%的复苏率，可能与经验不足有关，因此，在卵子复苏率上还有待进一步提高，冻融后卵子的受精及其胚胎发育需进一步深入研究，提高卵裂率。

稳定成熟的卵子冷冻技术是临床应用的前提，国内外有关卵子的玻璃化冷冻在睾丸取精失败周期中的临床应用仅有有限的文献报告，临床可行性尚需大样本证实[16]。经过冷冻和解冻程序之后GV期卵母细胞IVM困难依然存在[17]。本中心初步应用该技术，还存在卵子复苏率(68.2%)、优胚率(32.3%)偏低的问题，说明在卵子的玻璃化冷冻及解冻过程中，超低温可能给细胞透明带、超微结构(如膜结构、细胞骨架等)、纺锤体等带来了损伤，使冷冻卵子复苏后不能完全自我修复，从而不能发育成优质胚胎，甚至囊胚[18]。从妊娠结局来看，3例临床妊娠所移植的胚胎均有优质胚胎，说明卵子在冷冻、解冻、ICSI后若能形成优质胚胎，则该胚胎具备良好的发育潜能，移植后更有可能获得理想的结局，也说明我生殖中心采用的卵子玻璃化冷冻体系是可行的。随着实践经验的积累，该体系可不断完善成为成熟的卵子玻璃化冻融方案。

冻存卵母细胞活产婴儿的数量在过去十年迅速增加，玻璃化冷冻技术的发展必然伴随着产科和围产期结局，以及婴儿的长期发展评估[17]。尤其是标本直接与液氮接触带来的污染问题以及高浓度冷冻保护剂的毒性影响，还有冷冻技术本身带来的一定遗传风险都决定今后研究方向应为冷冻方法的优化与安全性[8]。由于缺乏高育龄妇女的数据和用于长期储存的卵母细胞冻存数据，迄今文献可靠性也存在局限性[17]。因此，这些信息还不能涵盖整个生殖医学领域。一项研究初步分析了玻璃化冷冻卵母细胞后的165例妊娠者和200名婴儿的产科和围产期结局[18]，其平均出生体重和先天畸形的发生率与不孕妇女接受体外受精治疗或自然怀孕育龄妇女相当，这提示通过使用卵子玻璃化冷冻治疗出现的低怀孕率和低出生体重婴儿率与产科和围产期结局风险的增加不相关。仅意大利就有约2 000名为卵母细胞冻存出生的婴儿，至今没有异常婴儿数量增加的报告[11]。目前有限的资料提示此项技术是安全的，但还需要进一步的研究。

随着进一步的深入研究，卵母细胞玻璃化冷冻的标准程序将会被提出，可综合女性的年龄和冷冻保存的原因，为其提供合理的信息以帮助做出明智的选择，以解决女性生育力保存的问题。未来对于卵母细胞冻存的研究成果，将为辅助生殖治疗提供更深入的见解。

[1] 卢兴宏,黄艳仪,龙晓林,等.不同成熟阶段、不同来源的人类卵子冷冻后发育潜能的比较[J].实用医学杂志,2006,22(12):1 378-1 379.

[2] 佚名.什么叫“玻璃化冷冻卵子技术”?[J].中国优生与遗传杂志,2005,13(7):124.

[3] Nagy ZP,Chang CC,Shapiro DB,et al.Clinical evaluation of the efficiency of an oocyte donation program using egg cryo-banking[J].Fertil Steril,2009,92(2):520-526.

[4] Cil AP,Seli E.Current trends and progress in clinical applications of oocyte cryopreservation[J].Curr Opin Obstet Gynecol,2013,25(3):247-254.

[5] 唐志霞,曹云霞.卵子玻璃化冷冻保存生育力的研究进展[J].中国妇幼健康研究,2008,19(4):368-370.

[6] Cobo A,Diaz C.Clinical application of oocyte vitrification:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J].Fertil Steril,2011,96(2):277-285.

[7] 孙燕萍,牛向丽,陈自洪,等.玻璃化与程序化两种不同胚胎冻融方法的临床应用效果比较[J].中国计划生育和妇产科,2011,3(1):22-25.

[8] 滕晓明,李昆明,王 羽,等.卵子玻璃化冷冻在体外受精-胚胎移植中的初步应用[J].中华男科学杂志,2012,18(6):531-533.

[9] Simopoulou M,Asimakopoulos B,Bakas P,et al.Oocyte and embryo vitrification in the IVF laboratory:a comprehensive review[J].Folia Med(Plovdiv),2014,56(3):161-169.

[10]Mandelbaum J,Belaïsch-Allart J,Junca AM,et al.Cryopreservation in human assisted reproduction is now routine for embryos but remains a research procedure for oocytes[J].Hum Reprod,1998,13(Suppl 3):161-174.

[11]Cao Y,Xing Q,Zhang ZG,et al.Cryopreservation of immature and in-vitro matured human oocytes by vitrification[J].Reprod Biomed Online,2009,19(3):369-373.

[12]李 娜,苗聪秀,关素萍,等.玻璃化冷冻法在未成熟卵子冷冻技术中的应用[J].中国计划生育学杂志,2012,20(10):690-692.

[13]秦文松,刘 英,秦辉灵,等.人卵母细胞玻璃化冷冻技术在辅助生殖中的应用[J].中国性科学,2015,24(2):93-95.

[14]耿 洁,胡玉琴,刘兰兰.卵子玻璃化冷冻在体外受精-胚胎移植取精失败周期中的应用[J].实用医院临床杂志,2014,11(1):156-157.

[15]徐千花,曹云霞.卵子冷冻在女性生育力保存中的作用研究进展[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2008,27(5):276-279.

[16]宋文妍,孙莹璞,金海霞,等.卵子玻璃化冷冻在睾丸取精失败周期中的临床应用(附8例报告)[J].中华男科学杂志,2010,16(4):305-309.

[17]Chian RC,Wang Y,Li YR.Oocyte vitrification:advances,progress and future goals[J].J Assist Reprod Genet,2014,31(4):411-420.

[18]Chian RC,Huang JY,Tan SL,et al.Obstetric and perinatal outcome in 200 infants conceived from vitrified oocytes[J].Reprod Biomed Online,2008,16(5):608-610.

In vitro fertilization and embryo transfer using human oocytes with vitrified cryopreservation:a report of 9 cases

HUANGHua,WULing-yuan,TANGXiu-fa,CHENZi-hong,SUNYan-ping,NIUXiang-li

(ResearchCenterforPopulationandFamilyPlanningofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To explore the effect of vitrification of human oocytes applied to in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET).Methods Nine patients who could not be fertilized due to male factors underwent IVF-ET.The mature ova of these patients were treated with vitrified cryopreservation.Intracytoplasmic sperm injection(ICSI) was conducted after the ova were thawed.The recovery,fertilization,segmentation and pregnancy after transplantation were recorded.Results A Total of 58 ova were thawed in the 9 patients,and the recovery rate was 68.2%(58/85) .Of the mature ova received ICSI after recovery,40 ova were fertilized and 34 developed into embryos.The fertilization rate and segmentation rate were 69.0% and 85.0% respectively.In 7 transplantation cycles,15 embryos were transplanted and clinical pregnancy was completed in 3 cases,and the clinical pregnancy rate was 42.9%.Conclusion Vitrified cryopreservation of human oocytes can achieve satisfactory clinical pregnancy rate.IVF-ET can be one of the choices for clinical therapy. 【Key words】 In vitro fertilization,Embryo transfer,Vitrified cryopreservation,Intracytoplasmic sperm injection,Oocyte

广西壮族自治区计划生育委员会科研项目(桂人口计生研1109，桂人口计生研1102)

黄华(1983～)，男，硕士，助理研究员，研究方向：胚胎实验。

牛向丽(1978～)，女，硕士，助理研究员，研究方向：胚胎实验，E-mail：59075287@qq.com。

R 169

A

0253-4304(2016)07-0941-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.07.14

2016-02-04

2016-05-04)