麝香草酚《中国药典》2015年版微生物限度检查法方法学研究

刘绪平 张文婷#

（1江西省药品检验检测研究院南昌 330029；2江西省药品与医疗器械质量工程研究技术中心南昌 330029）

●中西药苑●

麝香草酚《中国药典》2015年版微生物限度检查法方法学研究

刘绪平1，2张文婷1，2#

（1江西省药品检验检测研究院南昌 330029；2江西省药品与医疗器械质量工程研究技术中心南昌 330029）

目的：建立麝香草酚《中国药典》2015年版微生物限度检查方法。方法：需氧菌总数检查为薄膜过滤法，冲洗量为800 ml；霉菌和酵母菌总数检查为薄膜过滤法，冲洗液为pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，冲洗量为800 ml；大肠埃希菌检查、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查均为薄膜过滤法，冲洗液为pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，冲洗量为800 ml。结果：在三次独立平行的试验中，5株试验菌的回收比值0.5～2.0。结论：该方法消除了样品的抑菌性，可用于该品种的微生物限度检查。

麝香草酚；微生物限度检查；方法验证

麝香草酚即5-甲基-2异丙基苯酚，为《中国药典》2015年版四部收录药用辅料，为一种抑菌剂[1]。其杀菌作用比苯酚强，且毒性低，对口腔咽喉黏膜有杀菌、杀真菌作用，对龋齿腔有防腐、局麻作用，用于口腔、咽喉的消毒杀菌、皮肤癣菌病、放射菌病及耳炎。能促进气管纤毛运动，有利于气管黏液的分泌，易起祛痰作用，再加有杀菌作用，故可用于治疗气管炎、百日咳等。《中国药典》2015年版的微生物限度检查法结合国情参考美国药典进行修订[2]，在培养基、培养条件和检验方法及结果判断上与2010年版相比做了重大的改变。本文对3批麝香草酚辅料微生物限度检查的方法学进行研究，需氧菌总数检查和霉菌和酵母菌总数检查均为薄膜过滤法；大肠埃希菌检查、金黄色葡萄球菌检查和铜绿假单胞菌检查均为薄膜过滤法。并对方法进行验证，结果表明该方法有效可行，较之2010年版方法在许多方面更加能有效科学地控制该品种微生物质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器YXQ-LS-50SⅡ高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业医疗器械有限公司）；D8523CTL-2W格兰仕微波炉（顺德格兰仕微波炉电器有限公司）；Sartorius T601-L电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SW-CJ-2D净化工作台（苏州净化有限公司）；Heal Force-900C生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；PYX-DHS细菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；MJ-160B霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 试药试验菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]。胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基均由北京路桥技术有限责任公司提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备取经35℃培养18～24 h金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的新鲜培养物1 ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-3～10-7，做活菌计数备用。取经25℃培养18～24 h白色念珠菌新鲜培养物1 ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-4，做活菌计数备用。取经25℃培养1周的黑曲霉新鲜培养物，加入5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1 ml，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-4，做活菌计数备用。

2.2 供试液的制备取供试品10 g置三角烧瓶中，加吐温80和司盘80各3 ml，再加45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，摇匀，作为1∶10供试液。

2.3 需氧菌总数计数法的验证回收测定：薄膜过滤法。（1）试验组：取供试液1 ml，采用薄膜过滤法，每筒用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 ml分8次冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu试验菌，滤干，立即贴膜于胰酪大豆胨琼脂培养基，置30～35℃培养箱培养24～72 h逐日观察结果。（2）供试品对照组：取上述制备好的供试液，以稀释液代替菌液，同试验组操作，测定供试品本底菌数。（3）菌液对照组：取相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。（4）回收比值的计算：按如下公式计算试验组的加菌回收比值：试验组的加菌回收比值=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液对照组的平均菌落数。参照《中国药典》2015年版四部通则1105选取枯草芽孢杆菌进行预试验，取1∶10供试液1 ml，采用薄膜过滤法，每筒冲洗量分别为300、500、800 ml，回收比值分别为0、0.2、0.7，所以其他菌株试验冲洗量都取800 ml。见表1。

表1 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法学验证结果

2.4 霉菌和酵母菌总数计数法的验证回收测定：薄膜过滤法。（1）试验组：取供试液1 ml，采用薄膜过滤法，每筒用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 ml分8次冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu试验菌，滤干，立即贴膜于沙氏葡萄糖琼脂培养基，置20～25℃培养箱培养24～120 h逐日观察结果。（2）供试品对照组：取上述制备好的供试液，以稀释液代替菌液，同试验组操作，测定供试品本底菌数。（3）菌液对照组：取相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。（4）回收比值的计算：按如下公式计算试验组的加菌回收比值：试验组的加菌回收比值=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液对照组的平均菌落数。见表1。

2.5 控制菌检查方法的验证

2.5.1 大肠埃希菌检查法供试液的制备同“2.2”项下1∶10供试液的制备。试验组：取上述供试液10 ml，薄膜过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 ml分8次冲洗，加入不大于100 cfu大肠埃希菌试验菌（将试验菌加入最后一次冲洗液中），取膜加入100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，置35℃培养18～24 h，取上述培养物1 ml接种至100 ml麦康凯液体培养基中，42℃培养24～48 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～72 h，取麦康凯琼脂平板上菌落经纯化后的培养物，接种至含5 ml MUG培养基的试管内，培养，于5、24 h在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿管壁加入数滴靛基质试液，观察。阴性对照组：取稀释液10 ml照大肠埃希菌检查法操作。见表2。

表2 大肠埃希菌检查法方法学验证试验结果

2.5.2 金黄色葡萄球菌检查法供试液的制备同“2.2”项下1∶10供试液的制备。试验组：取上述供试液10 ml，薄膜过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 ml分8次冲洗，加入不大于100 cfu金黄色葡萄球菌试验菌（将试验菌加入最后一次冲洗液中），取膜加入100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养24 h，取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，置35℃培养18～72 h，观察结果。阴性对照组：取稀释液10 ml照金黄色葡萄球菌检查法操作。见表3。

表3 金黄色葡萄球菌检查法方法学验证试验结果

2.5.3 铜绿假单胞菌检查法供试液的制备同“2.2”项下1∶10供试液的制备。试验组：取上述供试液10 ml，薄膜过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 ml分8次冲洗，加入不大于100 cfu铜绿假单胞菌试验菌（将试验菌加入最后一次冲洗液中），取膜加入100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养24 h，取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，置35℃培养18～72 h，观察结果。阴性对照组：取稀释液10 ml照铜绿假单胞菌检查法操作。见表4。

表4 铜绿假单胞菌检查法方法学验证试验结果

3 讨论

《中国药典》2015年版将检查项目细菌总数计数改为需氧菌总数计数，包括《中国药典》2010年版规定的细菌数、霉菌及酵母菌总数。因为在日常检查中经常能够碰到在营养琼脂培养基上出现酵母菌或霉菌，有的酵母菌生长较小，特征不明显，难以判断是否为细菌[3]。《中国药典》2015年版需氧菌总数检查所用的培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基，《中国药典》2010版细菌中细菌总数检查所用的培养基为营养琼脂培养基，同等时间和同等条件下培养，胰酪大豆胨琼脂培养基较营养琼脂培养基培养出的菌落大，易计数[4]。

《中国药典》2010年版细菌总数计数法三株验证用阳性细菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌。将其中大肠埃希菌改为铜绿假单胞菌，根据王慧玲等在2013年常见分离菌分布及耐药变迁文献中报道，2013年全年病人送诊的32566份细菌培养标本，检出的3684株分离菌株中大肠埃希菌排名第一[5～6]。说明大肠埃希菌临床耐药性高。而根据我单位自2006年至今10年对近2 000个品种进行的微生物限度检查方法学研究结果表明，细菌计数法敏感菌株95%以上为金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，通常大肠埃希菌验证只需要1∶10供试液平皿法便可达到70%以上的回收率，故新版药典改用同为革兰氏阴性无芽孢杆菌的铜绿假单胞菌来作为这类菌的代表菌株用于验证，更加科学。

本品种为新版药典四部新收录的药用辅料品种。其在水中微溶，故要制备成均一的1∶10溶液，需要加入一定比例的分散剂或者乳化剂，根据试验摸索，选择了100 ml供试液中加吐温80和司盘80各3 ml，分散效果较好。又由于其具有较强的抑菌性，所以直接选择了薄膜过滤法，并选取枯草芽孢杆菌做预实验考察了不同冲洗量的回收比值，确定了800 ml/筒冲洗量，并通过其他几株试验菌的验证了方法的可行性。结合新版药典更加科学合理的方法体系，通过完善细致的实验过程，找到了该品种较佳的微生物限度检查方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2015年版一部.北京:中国医药科技出版社,2015.979

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2015年版四部.北京:中国医药科技出版社,2015.附录1105-1106

[3]金莞尔,俞年生.菌落计数时常见的几个难题[J].浙江预防医学, 2000,12(4):63

[4]由亚宁,陈雪芹,周志云,等.2005年版《中国药典》和《欧洲药典》菌落计数培养基比较[J].中国药事,2010,24(6):587-589

[5]王慧玲,卢先雷.2013年常见分离菌分布及耐药变迁[J].华西医学, 2016,31(2):287-292

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2010年版一部.北京:中国医药科技出版社,2010.附录79

Verification and Evaluation of Methodology on the Microbial Limit Test for Thymol by ChP 2015

LIU Xu-ping1,2,ZHANG Wen-ting1,2#
(1Jiangxi Institute for Drug Control,Nanchang330029; 2Jiangxi Provicial Engineering Research Center for Drug and Medical Device,Nanchang330029)

Objective:To provide a method of microbial limit test for thymol and carry out the verification of the mothed.Mothed: Membrane filtration method was used in total aerobic microbial count and total yeast and mould count with pH 7.0 sodium chloride-peptone buffer 800 ml as flush fluid.Membrane filtration method was used for the detection of Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa with pH 7.0 sodium chloride-peptone buffer 800 ml as flush fluid.Results:In 3 parallel independent experiments,the recovery rate of 5 positive bacterium were 0.5～2.0.Conclusion:It can eliminate the antimicrobial properties,and it can be used for the microbial limit test for thymol.

Thymol;Microbial limit test;Method validation

R927.1

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.12.045

2016-10-17）

#通讯作者：张文婷，E-mail：2819176959@qq.com