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“肺肠同治”法对脓毒症大鼠肺基质金属蛋白酶及其抑制物表达的影响

2016-02-10陈素珍楼黎明胡丹丹黄立搜王世强徐一凯

浙江中西医结合杂志 2016年8期
关键词:同治大肠蛋白酶

陈素珍 楼黎明 胡丹丹 黄立搜 王世强 徐一凯 章 潜

“肺肠同治”法对脓毒症大鼠肺基质金属蛋白酶及其抑制物表达的影响

陈素珍 楼黎明 胡丹丹 黄立搜 王世强 徐一凯 章 潜

目的根据“肺合大肠”理论拟定治肺、治肠、肺肠同治方药,观察不同治法对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比值的变化,探讨“肺肠同治”法治疗脓毒症肺损伤的作用机制。方法将清洁级SD雄性大鼠50只随机分为假手术组、模型组、治肺组、治肠组、肺肠同治组,每组10只。以盲肠结扎穿孔(CLP)法制备脓毒症大鼠模型,观察CLP术后24h大鼠肺组织匀浆中MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比值、肺湿/干重比(W/D)的情况。结果与假手术组比较,模型组、治肺组、治肠组、肺肠同治组大鼠肺湿/干重比均明显增大(P<0.01);与模型组比较,治肺组、治肠组、肺肠同治组的大鼠肺湿/干重比均显著减小(P<0.01或P<0.05)。与假手术组比较,模型组、治肺组、治肠组、肺肠同治组的大鼠MMP-9、TIMP-1显著增高(P<0.01或P<0.05),TIMP-1/MMP-9比值显著下降(P<0.01或P<0.05)。与模型组比较,治肺组、治肠组、肺肠同治组大鼠MMP-9降低[(12.56±0.76)、(12.50±0.98)、(10.50±0.71)比(14.80±0.59),P<0.05],TIMP-1显著下降[(14.10±1.12)、(14.30±1.30)、(10.90±0.53)比(17.70±1.06),P<0.05],TIMP-1/MMP-9比值显著升高[(0.91±0.04)、(0.90±0.04)、(0.98±0.03)比(0.84±0.03),P<0.05]。结论“治肺”法、“治肠”法、“肺肠同治”法均可以下调肺损伤模型大鼠肺组织MMP-9基因与TIMP-1基因表达,从而减轻脓毒症大鼠的肺损伤,对肺脏有一定的保护作用,其中以肺肠同治法效果最好。

大鼠;脓毒症;肺肠同治;MMP-9;TIMP-1

脓毒症是指感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS),是目前ICU中的首要死亡原因,具有患病率、病死率、治疗费用高等特点[1-2]。在脓毒症所致的多器官功能不全(MODS)中,常是最早受损的器官,临床表现为进行性呼吸困难、紫绀、气促喘憋等急性肺损伤的肺气壅遏的症状,常同时伴有便秘腹胀等腑气不通、大肠失于传导的病理变化,其证候学体现了中医“肺合大肠”的特点[3-6]。本实验通过观察脓毒症大鼠的肺组织中基质金属蛋白酶-9(MMPs-9)及基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMPs-1)表达,探讨“肺肠同治”治法机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠50只,体质量220~250g,由浙江中医药大学实验动物中心提供并常规饲养,实验动物合格证号“SCXK(沪)2013-0016。

1.2 药物及主要试剂 治肺方(生石膏、苦杏仁、瓜蒌皮)、治肠方(生石膏、芒硝、厚朴、枳实)、肺肠同治方(生石膏、苦杏仁、瓜蒌皮、生大黄、芒硝、厚朴、枳实)中药颗粒剂,购自浙江中医药大学第一附属医院中药房,生药剂量比例按照文献换算[7]。各方煎煮浓缩后含生药0.65g/mL,依照人体单位体质量生药量求得大鼠的单位体积质量生药量,4℃冰箱保存备用。MMP-9、TIMP-1等试剂购自Cusabio生物公司(其中TIMP-1试剂盒序列号:CSB-E08005r,MMP-9试剂盒序列号:CSB-E08008r)。

2 实验方法

2.1 脓毒症模型建立[5-6]SD大鼠适应性饲养1周,脓毒症模型采用经典的盲肠结扎穿孔法(CLP)方法加以改进。具体如下:实验前12h禁食不禁水,实验时称重。腹腔注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后,以腹正中线作一1.5cm长的切口,找到盲肠,在其根部结扎,用18号针穿通3次,轻挤出少量场内容物,留置2mm皮瓣防止针孔闭合,还纳盲肠于腹腔,逐层缝合腹壁切口,术毕皮下注射生理盐水抗休克。操作中注意消毒,术后保暖。其中假手术组不行盲肠结扎与穿孔,余操作相同。

2.2 分组和给药 将SD大鼠按随机分配原则分为五组,每组10只:假手术组、模型组、治肺组、治肠组、肺肠同治组。治肺组、治肠组、肺肠同治组:造模前予相应药物灌胃(1mL/100g),1天1次,3天,于第3次灌胃后2h行CLP术造模,于术后24h麻醉并腹主动脉采血致死。余各组均于设定的相应时相点,给予相应的药物,其中假手术组和模型组均予生理盐水。

2.3 标本采样和制备

2.3.1 血清标本 然后用2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,仰卧固定乙醇消毒后,打开腹腔,暴露腹主动脉,缓慢取血,离心后得到上清液,转入EP管,于-70℃冻存。

2.3.2 肺组织标本 经采血处死后,取大鼠左肺放入无菌低温冻存管,于液氮中速冻,转存到-70℃冰箱保存备用,待全部实验结束后采用ELISA法测定肺组织匀浆中MMP-9、TIMP-1的含量;取右肺上叶,精确称湿重,再置于85℃烤箱中24h,至重量不再变化,称干重,计算肺湿/干重比。

2.4 指标检测

2.4.1 血气分析 获取处理后大鼠动脉血,采用全自动血气分析机检测PaO2/FiO2。

2.4.2 MMP-9、TIMP-1测定 ELISA检测大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1含量,操作严格按说明书进行。

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件,数据以均值±标准差(±s) ,计量资料采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐时作两两比较用LSD法,方差不齐时选Dunnett's T3法;P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠血气分析 与假手术组相比,模型组PaO2/FiO2含量显著降低(P<0.05)。治肺组和治肠组的PaO2/FiO2较模型组升高(P>0.05),但低于假手术组(P<0.05),肺肠同治组则较模型组明显增高(P<0.05),已非常接近假手术组。见表1。

3.2 各组大鼠肺组织湿/干重比(W/D)变化 与假手术组比较,模型组大鼠肺组织W/D明显增加(P<0.05);治肺组、治肠组和肺肠同治组的肺组织W/D也显著增加(P<0.05);与模型组比较,治肺组、治肠组和肺肠同治组大鼠肺组织W/D显著减少(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠动脉血PaO2/FiO2和肺W/D比较(±s)

表1 各组大鼠动脉血PaO2/FiO2和肺W/D比较(±s)

注:与假手术组比较,*P<0.05,与模型组比较,#P<0.05

3.3 各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1蛋白水平变化 与假手术组比较,模型组、治肺组、治肠组和肺肠同治组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1均明显升高(P<0.05),而TIMP-1/MMP-9比值则显著下降(P<0.05);与模型组比较,治肺组、治肠组或肺肠同治组大鼠MMP-9和TIMP-1显著下降,而MMP-9/ TIMP-1比值增高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1比值比较(±s)

表2 各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1比值比较(±s)

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01;MMP-9:基质金属蛋白酶-9;TIMP-1:基质金属蛋白酶抑制因子-1

组别假手术组模型组治肺组治肠组肺肠同治组鼠数10 10 10 10 10 MMP-9(ng/mL)9.18±0.59 14.80±0.59* 12.56±0.76*#12.50±0.98*#10.50±0.71##TIMP-1(ng/mL)9.05±0.53 17.70±1.06* 14.10±1.12*#14.30±1.30*#10.90±0.53#比值1.01±0.04 0.84±0.03* 0.91±0.04*#0.90±0.04*#0.98±0.03*##

4 讨论

基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)家族包含超过20类的细胞分泌因子和细胞表面酶,它们可以降解细胞外基质蛋白、凝血因子、脂蛋白、生长因子,并具有趋化细胞等作用[6-7]。MMP-9则被认为在ALI/ARDS的发生和进展中起着重要的作用[8-9]。MMP-9是MMPs中分子量最大的酶,因其作用底物广泛,表达细胞众多而备受重视。正常情况下MMP-9不在肺组织内表达,当炎性细胞被激活时,炎性因子大量释放,而促进MMP-9高表达[10]。脓毒症时,MMP-9可以增强放大炎症因子的效应,使中性粒细胞迁移在肺组织局部浸润,刺激肺组织局部的实质细胞释放出MMPs,放大并增加对肺组织的损伤。

金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)是MMPs的天然抑制物,其中TIMP-1是MMP-9的生理性抑制物,是一种以可溶性形式分泌到ECM中的糖蛋白,它以1:1的分子比例与MMP-9酶原的活化形式非共价结合,结合是不可逆而稳定的。Lauchou等[11]研究表明,MMP-9与TIMP-1比例失衡参与气道重建影响ARDS病程的长短。MMP-9与TIMP-1比值可能成为ARDS病程进展的预测值。Muhl等[12]对入住ICU的严重脓毒症患者进行动态MMPs及TIMPs观察,发现TIMP-1显著升高并随着时间而衰减,MMP-9/TIMP-1比值在最初的3天内显著降低。

本实验发现,模型组大鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1蛋白的表达强度均高于假手术组,P<0.05或P<0.01,与之前的报道[13]相符,提示MMP-9和TIMP-1参与了急性脓毒症肺损伤的发生发展。治肺组和治肠组给药治疗后,MMP-9和TIMP-1蛋白表达较模型组减少(P<0.05),而MMP-9和TIMP-1蛋白表达在肺肠同治组中降低更明显,与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组相比,模型组MMP-9/TIMP-1比值显著减低;肺肠同治组MMP-9/ TIMP-1较模型组明显增高,这也与肺肠同治组对W/D比值和血气分析影响效果一致。

本实验说明,治肺组、治肠组,尤其是肺肠同治组均能明显降低血浆TIMP-1蛋白含量,改善MMP-9/TIMP-1的平衡,抑制了MMP-9和TIMP-1在肺内的异常高度表达,促进MMPs/TIMPs的失衡状态恢复,预防脓毒症时肺损伤的发生。

近年来,中医治疗脓毒症取得一定的进展,“通利大肠”是治疗脓毒症的大法之一[3-4]。其理论基础源于《黄帝内经》记载的“肺合大肠,大肠者,传导之腑”。而“肺咳不已,则大肠受之。大肠咳状,咳而遗矢”则表明了肺与大肠不仅在生理方面密切相关,而且在病理上也存在相互影响和传变关系,肺失肃降,气机不利,影响大肠传导功能,导致腑气不通;肠腑壅实,腑气不利,阳明浊气上犯于肺,影响肺脏的宣发肃降,导致肺功能损害。急性脓毒症肺损伤常因肠腔内的细菌大量繁殖与毒素吸收入血,通过肠源性内毒素导致对肺脏的损害。其病机根本在于肺壅肠闭,肺壅则喘,肠闭则满。故本方治以通腑除满、清肺平喘。通腑汤的意义不在于泻下腑实,而是釜底抽薪,通下气机,肺气以降为顺,通腑汤通过降大肠之气而顺应肺气生理趋势,疏导止喘,以泻代补。微下之,恰恰反映通腑汤之功用不在泻实,而在于顺气调和下逐之间。已有的临床和实验研究证实,单纯“清热解毒利肺”或“通利大肠”均可调节脓毒症患者的炎症介质、免疫功能及凝血功能。

本实验通过对脓毒症大鼠肺脏病理学、肺湿/干重比变化、肺组织MMP-9/TIMP-1水平变化,显示脓毒症肺损伤存在肺基质金属蛋白酶及其抑制物表达异常;“肺肠同治”可更有效改善脓毒症肺损伤,其作用机制可能与抑制MMP-9的过度表达,调节失衡的MMP-9/TIMP-1,进而减轻肺组织损伤有关。

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(收稿:2015-11-09 修回:2016-02-22)

Effect of"Treat Lung and Colon Together"Prescription on the Expression of MMP-9 and TIMP in Rats with Sepsis

CHEN Suzhen,LOU Liming,HU Dandan,HUANG Lisou,WANG Shiqiang,XU Yikai,ZHANG Qian. Department of Respiratory Disease,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China

ObjectiveAccording to the"Treat Lung and Colon Together"theory,we developed prescriptions for the treatment of lung,colon and both,respectively.This study aimed to observe the effectof these prescriptions on the level of metalloproteinase-9(MMP-9),TIMP-1(metallopeptidase inhibitor 1)and the ratio of MMP-9/TIMP-1 in lung tissue of rats with acute lung injury and to explore the underlying mechanism.MethodsFifty SD male rats were randomly divided into 5 groups with 10 in each group:sham operation group,model group,lung treatment group,colon treatment group,lung and colon treatment group.Cecal ligation and puncture(CLP)was used to generate sepsis in rats in all groups except sham operation group;the level of MMP-9 and TIMP-1 and the ratio of MMP-9/TIMP-1 in lung tissue and lung wet/dry weight ratio(W/D)were observed in 24h after CLP.ResultsCompared with sham operation group,the W/D ratio was increased in model group and lung,colon or lung and colon treatment groups(P<0.01);compared with the model group,the W/D ratio was decreasedin lung,colon or lung and colon treatment groups(P<0.01 or P<0.05).Compared with sham operation group,the level of MMP-9 and TIMP-1 wasregulated and the ration of TIMP-1/MMP-9 was decreased in treatment groups(P<0.01 or P<0.05); compared with model group,lung,colon or lung and colon treatment groups had lower levels of MMP-9(12.56± 0.76,12.50±0.98,10.50±0.71 vs 14.80±0.59)and TIMP-1(14.10±1.12,14.30±1.30,10.90±0.53 vs 17.70±1.06)andhigher ration of TIMP-1/MMP-9(0.91±0.04,0.90±0.04,0.98±0.03 vs 0.84±0.03),with all P<0.05.ConclusionThe prescriptions from the"Treat Lung and Colon Together"theory can reduce the level of MMP-9 and decrease TIMP-1 in rats with sepsis,which is benefit to ameliorating lung injury.The effect is more prominent in lung and colon treatment group.

rats;sepsis;"Treat Lung and Colon Together"theory;MMP-9;TIMP-1

浙江省中医药科技计划项目(No.2012ZB069),浙江中医药大学课题(No.2013ZR03)

浙江中医药大学附属第三医院呼吸科(杭州 310005)

楼黎明,Tel:0571-88393530;E-mail:llm2348@hotmail.com

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