桔梗皂苷D对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抗肺癌细胞活性的影响

章艳斐

桔梗皂苷D对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抗肺癌细胞活性的影响

章艳斐

目的探讨中药活性成分桔梗皂苷D对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）抗肺癌细胞活性的影响及其机制。方法将人肺癌细胞系A549分为对照组、桔梗皂苷D组、TRAIL组及桔梗皂苷D联合TRAIL组，MTT法检测A549细胞活力，Annexin V/PI染色检测A549细胞凋亡，免疫共沉淀法检测A549细胞RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成，Western blot法检测A549细胞caspase-8的活化。结果对照组、桔梗皂苷D组、TRAIL组、桔梗皂苷D+TRAIL组对A549细胞活力的抑制率分别为0、（7.6±0.7）%、（13.4±1.0）%、（60.3±4.2）%，桔梗皂苷D组、TRAIL组、桔梗皂苷D+TRAIL组的细胞活力抑制率与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。对照组、桔梗皂苷D组、TRAIL组、桔梗皂苷D+TRAIL组对A549细胞凋亡的诱导率分别为（1.6±0.2）%、（4.5±0.3）%、（7.2±0.5）%、（40.2±2.8）%，TRAIL组、桔梗皂苷D+TRAIL组的细胞凋亡率较对照组有明显提高（P＜0.05）。桔梗皂苷D+TRAIL组A549细胞内的RIP1-FADD-caspase-8复合物水平及caspase-8的活化程度显著提高。RIP1 siRNA及z-IETD-fmk能显著抑制桔梗皂苷D对TRAIL的协同作用。对照组、桔梗皂苷D+TRAIL组、桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA组、桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk组对A549细胞活力的抑制率分别为0、（61.2±5.0）%、（24.5±1.9）%、（17.5±1.7）%，与桔梗皂苷D+ TRAIL组比较，桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA组、桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk组的细胞活力抑制率明显降低（P＜0.05）。对照组、桔梗皂苷D+TRAIL组、桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA组、桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk组对A549细胞的凋亡诱导率分别为（1.8±0.2）%、（39.5±2.6）%、（12.3±1.1）%、（9.4±0.8）%，与桔梗皂苷D+TRAIL组比较，桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA组、桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk组的细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。结论桔梗皂苷D可能通过促进死亡受体复合物的形成，增强TRAIL对肺癌细胞的凋亡诱导效应。

人肺癌细胞系A549；桔梗皂苷D；TRAIL；caspase-8；凋亡

肺癌是危害人类健康的世界性难题，死亡率居所有恶性肿瘤的首位，我国肺癌的5年存活率不足15%[1]。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是TNF家族的成员，能与死亡受体4（DR4）或死亡受体5 （DR5）结合，从而激活半胱天冬酶-8（caspase-8）并诱导肿瘤细胞发生凋亡[2]。研究发现，很多肿瘤细胞对TRAIL的抗肿瘤作用不敏感，并能抵抗TRAIL依赖的凋亡效应[3-4]。因此研究如何提高肿瘤细胞对TRAIL的敏感性是目前研究工作的重点。本文探讨桔梗皂苷D是否能提高肺癌细胞对TRAIL治疗的敏感性并研究其机制。

1 材料与方法

1.1 材 料 噻唑蓝（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT），桔梗皂苷D(osthole)，z-IETD-fmk，Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购于美国Sigma-Aldrich。肿瘤坏死因子凋亡诱导配体（TRAIL）购于美国R&D Systems。细胞蛋白提取液、RIP1（受体相互作用蛋白激酶1）、FADD（Fas相关死亡域蛋白）、caspase-8、cIAP2（细胞凋亡抑制蛋白2）和β-肌动蛋白（β-actin）抗人抗体购于美国Cell Signa-ling。蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠购于美国Santa Cruz。RIP1 siRNA购于上海吉玛生物，序列为：正向：5’-GGGCGAUAUUUGCAAAUAAUU-3’，反向：5’-UUAUUUGCAAAUAUCGCCCUU-3’。Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen。ECL（增强型化学发光底物）试剂盒购于美国Pierce。

1.2 细胞培养 人肺癌细胞系A549购于美国ATCC（美国模式菌种收集中心）。细胞系培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37°C恒温培养箱中培养，通入5%CO2。

1.3 细胞活力检测 将A549细胞按5×103/孔接种在96孔板上，对照组为A549细胞不加药物培养48h，桔梗皂苷D组为在A549细胞培养体系中加入5μmol/L的桔梗皂苷 D培养 48h，TRAIL组为在A549细胞培养体系中加入5pg/L的TRAIL培养48h，桔梗皂苷D联合TRAIL组为在A549细胞培养体系中加入5μmol/L的桔梗皂苷 D和 5pg/L的TRAIL培养48h。培养完毕后加20μL的5g/L MTT再培养4h。弃上清，往孔中加入150μL二甲亚砜，570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD实验组）/ OD对照组×100%。

1.4 免疫共沉淀 将A549细胞按5×105/孔接种在6孔板上，对照组为A549细胞不加药物培养48h，桔梗皂苷D组在A549细胞培养体系中加入5μmol/L的桔梗皂苷D培养48h，TRAIL组为在A549细胞培养体系中加入5pg/L的TRAIL培养48h，桔梗皂苷D联合 TRAIL组为在A549细胞培养体系中加入5μmol/L的桔梗皂苷D和5pg/L的TRAIL培养48h。之后将细胞用免疫沉淀缓冲液裂解。缓冲液成分：50 mmol/L Tris–HCl（pH7.4），1%NP-40细胞裂解液，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1%混合蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）。裂解后的细胞在12 000g下离心10min，收取上清液加入RIP1抗体孵育过夜，之后加入蛋白G琼脂糖珠孵育2h。免疫沉淀反应后，在1200g速度下离心5min，将琼脂糖珠离心至管底，之后将上清小心吸去，琼脂糖珠用免疫沉淀缓冲液洗涤2次后加入western blot上样缓冲液，沸水浴煮5min。

1.5 Western blot实验 将A549细胞按5×105/孔接种在6孔板上，对照组为A549细胞不加药物培养48h，桔梗皂苷D组为在A549细胞培养体系中加入5μmol/L的桔梗皂苷 D培养 48h，TRAIL组为在A549细胞培养体系中加入5pg/L的TRAIL培养48h，桔梗皂苷D联合TRAIL组为在A549细胞培养体系中加入 5μmol/L的桔梗皂苷D和5pg/L的TRAIL培养48h。之后将细胞用生理盐水洗涤两遍后提取总蛋白质。将蛋白提取液或免疫共沉淀处理样品用12.5%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用RIP1、FADD、caspase-8、cIAP2、β-actin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。目的蛋白的相对表达用目标蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用Image J软件处理。对于免疫共沉淀结果，Input表示在加入RIP1抗体和琼脂糖珠之前，预先留取的相同含量的样品蛋白作为对照。IP：RIP1表示加入RIP1抗体和琼脂糖珠之后的免疫共沉淀蛋白。

表1 桔梗皂苷D促进TRAIL对肺癌细胞的抗肿瘤活性（±s）

表1 桔梗皂苷D促进TRAIL对肺癌细胞的抗肿瘤活性（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与TRAIL组比较，△P＜0.05

组别对照组桔梗皂苷D组TRAIL组桔梗皂苷D+TRAIL组孔数 桔梗皂苷D浓度（μmol/L）TRAL浓度（pg/L）3 3 3 3 0 5 0 5 0 0 5 5细胞活力抑制率（%）0 7.6±0.7* 13.4±1.0* 60.3±4.2*△凋亡诱导率（%）1.6±0.2 4.5±0.3 7.2±0.5* 40.2±2.8*△

2 结果

2.1 桔梗皂苷D促进TRAIL对肺癌细胞凋亡诱导效应 MTT细胞活力实验及细胞凋亡实验显示，桔梗皂苷D显著提高TRAIL对A549细胞的杀伤活性和凋亡诱导活性，见表1。

2.2 桔梗皂苷D促进TRAIL依赖的DISC的形成免疫共沉淀及Western blot实验显示，桔梗皂苷D能显著促进TRAIL依赖的RIP1-FADD-caspase-8这一死亡受体复合物（DISC）的形成（图1），进而显著激活细胞内的caspase-8（图2）。

图1 桔梗皂苷D促进TRAIL依赖的RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成

图2 桔梗皂苷D促进TRAIL依赖的caspase-8的活化

2.3 桔梗皂苷D通过DISC-caspase-8途径增强肺癌细胞对TRAIL的敏感性 转染RIP1 siRNA或用caspase-8特异性抑制剂z-IETD-fmk[5]预处理后，桔梗皂苷D对TRAIL的协同抗肿瘤作用受到抑制，见表2。

3 讨 论

研究发现，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）能选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡，却不影响

1.6 细胞凋亡实验 将A549细胞按5×105/孔接种在6孔板上，对照组为A549细胞不加药物培养48h，桔梗皂苷D组为在A549细胞培养体系中加入5μmol/L的桔梗皂苷 D培养 48h，TRAIL组为在A549细胞培养体系中加入 5pg/L的TRAIL培养48h，桔梗皂苷D联合TRAIL组为在A549细胞培养体系中加入 5μmol/L的桔梗皂苷D和5pg/L的TRAIL培养48h。之后将细胞用生理盐水洗涤2次，按照凋亡试剂盒说明书步骤将PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，凋亡率用annexin-V阳性、PI阴性细胞数占总细胞数的百分比表示。正常组织细胞的功能，因此，TRAIL被认为是一种有很好前景的低毒抗肿瘤药物[6-7]。然而一些肿瘤细胞对TRAIL的抵抗性限制了TRAIL的临床应用，因此研究如何提高肿瘤细胞对TRAIL的敏感性是目前研究工作的重点。桔梗皂苷D是桔梗总皂苷的主要活性成分，具有抗炎、镇痛和免疫调节的作用，最近也有文献报道，桔梗皂苷D具有一定的抗肿瘤活性，如桔梗皂苷D能抑制肝癌细胞的增殖、转移和细胞周期[8-9]。然而，桔梗皂苷D对肺癌的辅助治疗作用却很少报道。本研究发现桔梗皂苷D能显著提高TRAIL对肺癌细胞的凋亡诱导能力。

表2 桔梗皂苷D通过DISC-caspase-8途径增强肺癌细胞对TRAIL的敏感性（±s）

表2 桔梗皂苷D通过DISC-caspase-8途径增强肺癌细胞对TRAIL的敏感性（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与桔梗皂苷D+TRAIL组比较，△P＜0.05

组别对照组桔梗皂苷D+TRAIL组桔梗皂苷D+TRAIL+RIP1 siRNA组桔梗皂苷D+TRAIL+z-IETD-fmk组孔数桔梗皂苷D浓度（μmol/L）TRAL浓度（pg/L）RIP1 siRNA浓度（pmol/ml）z-IETD-fmk浓度（μmol/L）3 3 3 3 0 5 5 5 0 5 5 5 0 0 5 0 0 0 0 0 2 0细胞活力抑制率（%）0 61.2±5.0* 24.5±1.9△17.5±1.7△凋亡诱导率（%）1.8±0.2 39.5±2.6* 12.3±1.1△9.4±0.8△

当TRAIL与其细胞表面的DR4和DR5受体结合后，能募集RIP1，进而形成RIP1-FADD-caspase-8这一死亡受体复合物（death-inducing signaling complex，DISC），最后激活caspase-8依赖的凋亡途径[10]。因此，为了研究桔梗皂苷D提高A549细胞对TRAIL敏感性的机制，笔者采用免疫共沉淀技术研究DISC的形成。实验结果发现，桔梗皂苷D能显著增加FADD蛋白、前体caspase-8蛋白与RIP1蛋白的结合，并且桔梗皂苷D也能促进caspase-8的活化。而当用RIP1 siRNA沉默RIP1的表达，以减少RIP1-FADD-caspase-8复合物的水平，或用z-IETD-fmk阻断caspase-8的活化后，桔梗皂苷D对TRAIL的协同作用丧失，显示桔梗皂苷D通过促进死亡受体复合物的形成，增强TRAIL对肺癌细胞的凋亡诱导效应。

实验结果显示，桔梗皂苷D能显著提高肺癌细胞对TRAIL的敏感性。通过机制研究我们发现桔梗皂苷D能使肺癌细胞在TRAIL的治疗下易于形成死亡受体复合物，进而诱导肿瘤细胞进入凋亡程序。这些研究为如何提高TRAIL的抗肿瘤活性提供了新的思路和理论依据。

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（收稿：2015-12-23 修回：2016-03-03）

Platycodin-DPromotes TRAIL-induced Apoptosis in Lung Cancer

ZHANG Yanfei.Department of Pathology,Central Hospital of Jinhua City,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate the role of platycodin-Din TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）-induced cell death in lung cancer.MethodsThe A549 cells were divided into control group,platycodin-D group, TRAIL group,and platycodin-D+TRAIL group,then the cell death,cell apoptosis,and the formation of RIP1-FADD-caspase-8 complex were detected by MTT assay,AnnexinⅤ/PI staining,and co-immunoprecipitation,respectively.The activation of caspase-8 in A549 cells was evaluated by western blot assay.ResultsThe cell viability inhibitory rate of A549 cells in control group,platycodin-D group,TRAIL group,and platycodin-D+TRAIL group was as follows：0,（7.6±0.7）%,（13.4±1.0）%,and（60.3±4.2）%;significant differences in the cell viability inhibitory ratewas found between control group and platycodin-D group,TRAIL group,and platycodin-D+TRAIL group（all P＜0.05）.The apoptotic ratio of A549 cells in control group,platycodin-D group,TRAIL group,and platycodin-D+TRAIL group was as follows：（1.6±0.2）%,（4.5±0.3）%,（7.2±0.5）%,and（40.2±2.8）%,with significant differences between control group and TRAIL group and platycodin-D+TRAIL group（all P＜0.05）.The formation of RIP1-FADD-caspase-8 complex and the activation of caspase-8 in TRAIL-treated A549 cells were signifi-cantly increased in platycodin-D+TRAIL group.Treatment of RIP1 siRNA and z-IETD-fmk significantly impaired the synergistic effect of platycodin-D on TRAIL-induced cell death.The cell viability inhibitory rate of A549 cells in control group,platycodin-D+TRAIL group,platycodin-D+TRAIL+RIP1 siRNA group,and platycodin-D+TRAIL+z-IETD-fmk group was as follows：0,（61.2±5.0）%,（24.5±1.9）%,（17.5±1.7）%;significant differences in the cell viability inhibitory ratewas noted between platycodin-D+TRAIL groupandplatycodin-D+TRAIL+RIP1 siRNA groupand platycodin-D+TRAIL+z-IETD-fmk group（all P＜0.05）.The apoptotic rate of A549 cells in control group,platycodin-D+TRAIL group,platycodin-D+TRAIL+RIP1 siRNA group,and platycodin-D+TRAIL+z-IETD-fmk group was as follows：（1.8±0.2）%,（39.5±2.6）%,（12.3±1.1）%,and（9.4±0.8）%,with significant differences betweenplatycodin-D+TRAIL groupand platycodin-D+TRAIL+RIP1 siRNA groupand platycodin-D+TRAIL+z-IETD-fmk group（all P＜0.05）.Conclusionplatycodin-D promotes TRAIL-induced apoptosis by the formation of RIP1-FADD-caspase-8 complex in lung cancer.

human lung cancer cell line A549;platycodin-D;TRAIL;caspase-8;apoptosis

浙江省金华市中心医院病理科（金华 321000）