山楂总黄酮对人肝细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

黄晓黎 陈益民 骆 丰

山楂总黄酮对人肝细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

黄晓黎 陈益民 骆 丰

目的观察山楂总黄酮对人肝细胞（HePG2）低密度脂蛋白受体表达的影响。方法用MTT法筛选出合适的山楂总黄酮作用浓度，用含不同浓度的山楂总黄酮培养液培养人肝细胞，基于细胞免疫技术，用荧光显微镜结合流式细胞术测定人肝细胞膜低密度脂蛋白受体的表达量和表达活性。结果随着山楂总黄酮浓度升高，人肝细胞低密度脂蛋白受体的表达量和表达活性增加。5、15、25μmol/L的山楂总黄酮在每10 000个人肝细胞中的肝细胞膜低密度脂蛋白受体表达量的平均荧光强度分别为11.21、14.39、19.67；每10 000个人肝细胞中的肝细胞膜低密度脂蛋白受体表达活性分别为6.34、10.11、16.77。结论山楂总黄酮能显著增加人肝细胞膜低密度脂蛋白受体的表达。

山楂总黄酮；人肝细胞；低密度脂蛋白受体；细胞免疫；流式细胞术

低密度脂蛋白（LDL）是胆固醇在人体血清中的主要存在形式，低密度脂蛋白浓度异常升高是造成冠状动脉粥样硬化的主要原因之一。位于肝细胞膜上的LDL受体通过受体介导的内吞作用能够吸收和降解血浆中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），因此LDL受体在调节低密度脂蛋白代谢和维持血浆胆固醇平衡方面起着非常重要的作用[1]。研究[2]表明，从山楂叶中提取的山楂总黄酮，具有明显的降胆固醇作用。人肝细胞（HePG2）LDL受体含量丰富，山楂总黄酮对人肝细胞（HePG2）的LDL受体表达的影响尚未见报道。本实验通过研究山楂总黄酮对HePG2的LDL受体表达的影响，探讨山楂总黄酮的调脂作用部位和机制，阐明山楂总黄酮的作用靶点。

1 材料与仪器

1.1 材料及试剂 HePG2：中科院上海细胞库提供；山楂总黄酮标准品（纯度≥98%）：购自安徽甙尔塔天然有机化合物信息中心，批号20130520。抗体：一抗：兔抗牛LDLR-IgG（浙江中医药大学生命科学学院制备），二抗：羊抗兔IgG-FITC（晶美生物工程公司）。DIL-LDL（浙江中医药大学制备）。

1.2 仪器及耗材 SW-CJ-IF层流超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），CO2培养箱（Heraeus），LDZ5-2型低速台式离心机（北京医用离心机厂），台式微量高速离心机（Heraeus），倒置显微镜（XDS-1B，COIC），荧光显微镜（德国Leica公司），Labsystems Dragon Wellscan MK-3型全自动多功能型酶标仪（Thermo Labsystems），流式细胞仪（Coulter EPICS RXL）。

2 方法

2.1 MTT法测定山楂总黄酮测定对HePG2细胞增殖的影响 以山楂总黄酮浓度梯度0、5、15、25、30、35、40μmol/L分7组，每组5个复孔。选择对数生长期的细胞HePG2，接种于96孔板；按照分组加入相应浓度的山楂总黄酮；空白组只加培养液。每孔加入5mg/mL MTT溶液，在波长为570nm处检测每孔吸光度（A），根据（A）判定药物对细胞增殖的影响。

2.2 LDL受体表达活性检测 设山楂总黄酮0、5、15、25μmol/L 4个浓度组，选择对数生长期的细胞HePG2，接种于96孔板；按分组加入山楂总黄酮，使其终浓度分别达到0、5、15、25μmol/L；收集细胞后加入DIL-LDL孵育；采用流式细胞术检测。

2.3 LDL受体表达量的检测 设山楂总黄酮0、5、15、25umol/L 4个浓度组，选择对数生长期的细胞HePG2，接种于96孔板；按分组加入山楂总黄酮，使其终浓度分别达到0、5、15、25μmol/L；一抗孵育：将细胞收集清洗后加入兔抗牛LDLR IgG，孵育2h；二抗孵育：将细胞收集清洗加入羊抗兔IgG-FITC，继续孵育2h；采用流式细胞术检测。

2.4 统计学方法 应用Excel统计工具分析，对MTT的结果进行统计，数据以均值±标准差（±s） 表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 山楂总黄酮对人肝细胞增殖的影响 MTT结果显示，0～30μmol/L的山楂总黄酮对人肝细胞的增殖影响差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 山楂总黄酮对人肝细胞增殖的影响（±s）

表1 山楂总黄酮对人肝细胞增殖的影响（±s）

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3.2 山楂总黄酮对人肝细胞HePG2 LDL受体表达活性的影响 因0～30μmol/L的山楂总黄酮对人肝细胞增殖影响差异无统计学意义（P＞0.05），故选择5、15、25μmol/L三个浓度。随着山楂总黄酮以0、5、15、25μmol/L浓度递增，其平均荧光强度也随着逐渐增大，分别为3.11、6.34、10.11、16.77，表明HePG2 LDL受体表达活性随着山楂总黄酮浓度的提高而增强。见图1（封四）。

3.3 山楂总黄酮对人肝细胞HePG2 LDL受体表达量的影响 随着山楂总黄酮0、5、15、25μmol/L浓度的增高，其平均荧光强度也随着逐渐增大，分别为6.11、11.21、14.39、19.67，表明HePG2 LDL受体表达量随着山楂总黄酮浓度的提高而增加。见图2（封四）。

4 讨 论

研究[2]表明，从山楂叶中提取的山楂总黄酮，具有明显的降低胆固醇和甘油三酯作用。但至今较少从细胞和分子水平作研究。本实验通过分析山楂总黄酮对人肝癌细胞HePG2 LDL受体表达的影响，研究其降脂作用部位和作用机制。

MTT法是一种准确、简便、快速的测定细胞增殖与抑制的方法。本实验通过MTT法检测0～40μmol/L的山楂总黄酮溶液对细胞增殖的影响。结果显示，山楂总黄酮溶液浓度在0～30μmol/L范围内山楂总黄酮溶液对人肝细胞增殖的影响差异无统计学意义（P＞0.05），说明对HePG2细胞生长基本没有影响。故本实验选择5、15、25μmol/L三个药物浓度。

荧光显微镜和流式细胞术结果表明，随着15～25μmol/L浓度的增加，山楂总黄酮溶液能显著增加HePG2 LDL受体的表达活性。通过检测抗体表达量而间接测定受体表达量，15～25μmol/L的山楂总黄酮溶液能显著增加HePG2 LDL受体的表达量，显示随着山楂总黄酮浓度的增高，受体表达总量增多。综上，15～25μmol/L的山楂总黄酮溶液能显著增加HePG2 LDL受体的表达。由于LDL受体表达受又多种信号调控通路的影响（SREBP途径，ERK途径）[3-4]，对于其分子机制有待进一步研究。

［1］李月琴，张淑华.中国汉族人群LDL受体基因Nco I多态性及其与血清高胆固醇的相关性研究［J］.中华医学遗传学杂志，2001，18（5）：406-407.

［2］王玲，吴军林，吴清平，等.山楂降血脂作用和机理研究进展［J］.食品科学，2015，36（15）：245-248.

［3］Wang YG，Yang TL.Liraglutide reduces oxidized LDL-inducedoxidative stress and fatty degeneration in Raw 264.7 cells involving the AMPK/SREBP1 pathway［J］.老年心脏病学杂志（英文版），2015，12（4）：410-416.

［4］Yu XH，Li XX，Zhao GJ，et al.MoOxLDL up-regulates Niemann-Pick type C1 expression through ERK1/2/COX-2/ PPARα-signaling pathway in macrophages［J］.生物化学与生物物理学报（英文版），2012，44（2）：119-128.

（收稿：2016-02-13 修回：2016-04-20）

Effect of Hawthorn Flavones on HePG2 Low-density Lipoprotein Receptors

HUANG Xiaoli,CHEN Yimin,LUO Feng Department of Clinical Laboratory,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the expression of HepG2 low-density lipoprotein（LDL）receptor affected by hawthorn flavones.MethodsMTT method was used to screen appropriate hawthorn flavone concentrations for culture of the HePG2 line.The numbers and activity of LDL receptorwere measured by cell immunity technology and flow cytometer technology.ResultsWith the increase in concentration of hawthorn flavones,the expression and activity of HepG2LDL receptorincreased.With 5-25 μmol/L amount of hawthorn flavone,the geometric mean of fluorescenevalue of LDL receptors on 10000 HepG2cellswas11.21,14.39,19.67 and the activity valuewas 6.34,10.11,16.77,respectively.ConclusionHawthorn flavones can up-regulate the expression of LDL receptorson HepG2.

hawthorn flavones;HepG2;lower-density lipoprotein receptor;cell immunity;flow cytometry

浙江省中医院检验科（杭州 310000）

黄晓黎，Tel：13758253131；E-mail：huangxiaoli8676@163.com