基于液相色谱-串联质谱联用技术的临床代谢组学中样本前处理方法的研究进展Δ

王　玮，王晓雪，李朋梅，张相林

(卫生部中日友好医院药学部，北京　100029)



基于液相色谱-串联质谱联用技术的临床代谢组学中样本前处理方法的研究进展Δ

王玮*，王晓雪，李朋梅，张相林#

(卫生部中日友好医院药学部，北京100029)

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后的新兴“组学”研究方法，是系统生物学的重要组成部分[1]。作为一门研究生物体内源性代谢物整体及其变化规律的科学，代谢组学以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标，对某一生物或细胞在特定生理时期内所有低分子量(<1 000 Da)代谢物同时进行定性和定量分析，具有较好的预见性和可靠性，可准确、有效地判定不良反应程度，是寻找新型可靠生物标记物的重要手段，在疾病的早期发现、机制研究以及药物安全性评价等方面发挥着重要作用[2-5]。临床代谢组学研究的样本包括生物液体和组织，由于尿液和血液收集简单、易于长期检测及包含大量的代谢信息，已成为代谢组学研究的常用标本。对样本进行适当的前处理，使检测的准确度、精密度、重现性等符合要求，是研究的基础。代谢组学的研究对象是生理、病理过程中的代谢产物，尽可能多地减少代谢产物的损失、获得更多的代谢产物是前处理的目标，同时，需兼顾方法重现性好、前处理步骤少、节约处理时间、尽量减少引起变异因素等。根据研究对象、研究目的等的不同，前处理具体步骤也不同。因此，做好生物样本的前处理是临床代谢组学研究的重要前提。初期，代谢组学研究主要采用核磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)、质谱法(mass spectrometry，MS)为核心的分析技术。近年来，不同类型串联质谱仪不断发展，其不仅可以实现高通量分析，还可同时获得分子离子和子离子的精确质量数，有利于获取分子式及代谢物的裂解特征信息、有效进行未知化合物的解析，因此非常适合寻找及鉴定标志物。由于其独特的研究角度和技术优势，MS已超过NMR成为应用最广泛的代谢组学工具，并迅速应用于医学、药学及生物学的各个研究领域，取得了巨大的成就[6-9]。本文对基于液相色谱-串联质谱联用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)的临床代谢组学研究中生物样本前处理方法进行综述。

1　尿液前处理方法

尿液中主要含有极性的低分子量代谢物，包括羧酸类、有机胺类、氨基酸类等，同时含有少量细胞、微量大分子物质以及磷酸盐、硫酸盐等各种盐类。尿液的前处理方法较其他体液相对简单，但其所含物质的极性、pH、渗透压等有较大差异，尤其机体处于压力状态时尿液中多种成分的差异性更大，这对尿液的前处理又带来一定的难度[2]。目前，尿液的前处理多采用离心后稀释的方法。首先将尿液离心后，用纯水或有机试剂以1 ∶1～1 ∶3的体积比进行稀释，随后转移至进样瓶或96孔板中，处理好的样本于0～4 ℃条件下储存待测。Guy等[10]的研究中，将收集到的尿液标本分装在1.5 ml EP管中，在-80 ℃下储存备用。检测前将样本在室温(25 ℃)下融化，精密量取25 μl，加入75 μl蒸馏水(高效液相色谱/MS级)稀释，稀释后的样本装入进样瓶，待测。Li等[11]曾报道，将800 μl乙腈加入800 μl尿液标本中，涡旋1 min混匀，13 000 r/min转速下离心10 min，取1 400 μl上清液挥干，用70%的乙腈200 μl复溶，涡旋1 min，4 ℃、13 000 r/min转速下离心10 min，取上清液进样等。这种将尿液稀释后进样的前处理方法，可减少尿液基质对LC-MS/MS分析测定的影响，最大限度减少分析物的丢失[12-13]，且简便易行。但是，稀释可能造成信号强度降低，使部分含量较低的代谢物可能无法被检测[14]。另外，也可通过分子过滤器除去尿液中微粒及少量蛋白质的方法进行前处理，如将1 ml尿液标本在4 000 r/min转速下离心10 min，取300 μl上清液，加入600 μl甲醇，涡旋10 min混匀，然后在4 ℃、14 000 r/min转速下离心10 min，取800 μl上清液经0.45 μm过滤器滤过后，低温保存待测[15]。这种处理方法可有效降低污染的风险，但处理成本稍高。此外，还有文献报道可将尿液冷冻干燥后用甲醇等有机溶剂进行提取[16]，该方法重现性较好，但可能会造成尿液中挥发性成分的丢失，改变尿液的特征代谢指纹谱[17]。

2　血液前处理方法

血液是代谢组学研究中重要的体液样本，其成分较尿液更为复杂。血液样本类型包括血清、血浆和全血。血清和血浆中所含成分种类繁多，极性跨度很大，同时含有大量的蛋白质。因此，应用LC-MS/MS进行分析前需去除蛋白，前处理方法需兼顾不同极性代谢物的性质，可实现多种代谢物的高通量监测。

2.1非靶向代谢组学

目前，非靶向代谢组学研究中血液样本前处理常用方法为有机溶剂沉淀法，多采用甲醇或乙腈作为蛋白沉淀剂处理血样。如Zhu等[18]曾报道，在50 μl血清中加入150 μl甲醇，涡旋2 min，-20 ℃下静置20 min，然后将样本在14 000 r/min转速下离心10 min，将上清液转移到新的EP管中；加入300 μl甲醇于下层沉淀，涡旋10 min，14 000 r/min转速下离心10 min；取上清液，与上次萃取的上清合并，将合并的萃取液挥干后，用500 μl乙腈-水(V∶V=60 ∶40，5 mmol/L醋酸铵，0.2%乙酸)复溶后进样。该方法对样本进行2次萃取，代谢物提取比较完全，但步骤较为繁琐，如果进行大批量样本前处理，则样品的均一性难以得到有效保证。目前，通用前处理方法是有机溶剂沉淀蛋白1次。通常向待测的血浆或血清样本中加入3倍体积的冰冻甲醇或乙腈，涡旋，12 000 r/min转速下离心10 min除去沉淀的蛋白；将离心后的上清液转移至新的EP管中，挥干后用水-乙腈混合溶液(V∶V=95 ∶5)复溶；涡旋，12 000 r/min转速下离心5 min，将上清液转移至进样瓶或96孔板等，将进样瓶等放入0～4 ℃自动进样器中进样分析[19-20]。另外，也有研究对样本沉淀蛋白后直接进样。具体处理为：100 μl血清样本中加入300 μl冰甲醇，涡旋30 s；4 ℃、14 000 r/min转速下离心10 min，取上清液进样分析[21]。该方法减少了浓缩步骤，操作较通用的方法更简单，但由于对样品进行了稀释，导致低含量代谢物有可能检测不到，所以对仪器灵敏度要求较高。以往文献中多采用甲醇或乙腈与待测血样3∶1的体积比进行蛋白沉淀，且采用冰冻的有机试剂或加入有机试剂后在-20 ℃下孵育一定时间进行前处理，可优化前处理方法。同时，也有文献采用有机试剂与血样4 ∶1的体积比进行前处理，如Luo等[22]曾报道，将100 μl血清中加入400 μl乙腈(含内标)，涡旋60 s，4 ℃、14 000 r/min转速下离心10 min，取200 μl上清液转移至EP管中挥干，用50 μl乙腈-水溶液(V∶V=1 ∶4)复溶，取上清液进样分析。此外，也有文献报道使用异丙醇作为沉淀剂，如50 μl血浆中加入150 μl冰冻异丙醇，室温(25 ℃)下孵育10 min，-20 ℃下过夜，然后在4 ℃、14 000 r/min转速下离心20 min，取100 μl上清液进样[23]。常用于化合物纯化、去除蛋白的固相萃取法，似乎并不太适合代谢组学的样本前处理。有研究通过考察不同有机溶剂沉淀蛋白和固相萃取技术对血浆中蛋白质的去除程度以及对待测物的提取效果，发现前者的提取效率和沉淀蛋白效果较好[24]。

2.2靶向脂质组学

在靶向脂质组学研究中，脂质类成分提取的“金标准”方法是采用三氯甲烷(CHCl3)-甲醇(V∶V=2∶1)混合溶剂进行提取[25]，也有报道采用二氯甲烷(CH2Cl2)-甲醇提取法[26]或甲基叔丁基醚(MTBE)-甲醇提取法[27]。习聪等[28]比较了CHCl3-甲醇(V∶V=2 ∶1)、CH2Cl2-甲醇(V∶V=2 ∶1)、MTBE-甲醇(V∶V=4 ∶1)3种混合溶剂作为提取溶剂时血清样本脂质类成分的提取效果，结果显示，CH2Cl2-甲醇的提取效果最佳，且CH2Cl2的毒性远小于CHCl3，采用CH2Cl2-甲醇作为提取剂的安全性较高。具体处理步骤如下：血清样本于4 ℃下解冻，取血清30 μl加入CH2Cl2-甲醇(V∶V=2 ∶1)(含0.1 g/L 2,6-二叔丁基-4-甲基酚，0 ℃)混合溶剂600 μl中，涡旋并静置，加入水200 μl，离心后取有机相氮气吹干，加入乙腈-异丙醇(V∶V=1 ∶1)混合溶剂500 μl，复溶，10 000 r/min转速下离心10 min后，取上清液进样。

3　组织前处理方法

不同组织器官的前处理方法各有不同。肝脏组织前处理可采用以下方法：取5 g左右肝脏组织，加入300 μl冰甲醇-水(V∶V=4 ∶1)混合溶液，混匀后放入组织匀浆仪中，将样本在冰上静置20 min，4 ℃下涡旋(转速为14 000 r/m)10 min，对上清液进样分析[21]。骨组织前处理可将冷冻在液氮中的骨组织取出，称取50 mg，用组织研磨机研磨，然后依次加入400 μl乙酸乙酯-乙醇混合液(V∶V=1 ∶1)、200 μl无水甲醇、200 μl无水甲醇-水(V∶V=3 ∶1)混合液、200 μl CH2Cl2-甲醇(V∶V=3 ∶1)混合液，其中每加入1种溶液后在研磨机中振摇2 min，12 000 r/min转速下离心5 min，取上清液，然后将多次萃取的上清液混匀，用氮气吹干，用100 μl甲醇-超纯水(V∶V=4 ∶1)混合液复溶，涡旋2 min，超声10 min，12 000 r/min转速下离心10 min后，取上清液进样[29]。

总之，临床生物样本所含化合物种类繁多、极性跨度大，既有高极性的氨基酸、核苷酸类、葡萄糖等，也有低极性的脂类、胆固醇类等成分。在分析前不仅需要除去基质以减少对色谱柱和质谱仪的干扰、污染，同时还要保证代谢物的全面、无差别、高通量的提取。如同一种分析检测平台不能够完全满足代谢组检测的要求，对生物样本的前处理单靠一种方法也往往难以实现全覆盖、快速分析的要求，在寻找代谢标志物的研究中更是如此。目前，临床代谢组学的样本前处理研究缺乏统一的标准操作规程。本文也仅是对通用前处理方法进行了总结。但是，相信随着前处理技术的不断创新，前处理条件的不断优化以及标准操作规范的逐步建立，生物样本的前处理会更简便、全面、高效。

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2016-06-17)

国家自然科学青年基金(No.81503175)；北京市自然科学青年基金(No.7154237)；中日友好医院青年基金(No.2014-3-QN-27)

主任药师，副教授，硕士生导师。研究方向：个体化给药与临床药理学。E-mail：zryhyyzxl@126.com

R969.1

A

1672-2124(2016)07-0868-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.002

*药师，硕士。研究方向：临床药学。E-mail：67671218@qq.com