人猪链球菌感染的临床实验室诊断研究进展

刘海珠，袁晓明



人猪链球菌感染的临床实验室诊断研究进展

刘海珠1，袁晓明2

1.大连医科大学附属威海市立医院检验科，威海264200，Email：haizhu.liu@outlook.com；2.山东省荣成市虎山畜牧兽医站，荣成264300

摘要：猪链球菌(S.suis)是一种重要的人兽共患病原菌，可感染人并导致严重的脑膜炎、败血症，甚至引起死亡。自1968年国际首次发现了2型猪链球菌引起人类严重感染的病例以来，国内外又有诸多相关报道。人类在感染该菌的早期并无特异性表现，但病情进展迅速，若不及时诊断并予以干预，死亡率较高。2005年6月至8月在四川省资阳、内江等地区相继暴发人感染猪链球菌病疫情，广泛引起了国内外的关注。由于S.suis不仅给养猪业造成很大威胁，而且严重危害公共卫生安全，对该菌进行准确的早期诊断是控制猪链球菌病流行的关键。目前，针对该病原体的常见实验室检测方法包括微生物检测法、免疫学检测法、分子生物学检测法及动物实验法等。本文将就人感染S.suis的实验室诊断研究进展做一简要综述。

关键词：猪链球菌；人兽共患病原菌；实验室诊断

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis, SS) 为椭圆形或橄榄状的单个或成对排列的革兰阳性球菌，多有荚膜，广泛存在于自然界及猪的扁桃体和气管分泌物中，是一种重要的人兽共患病原菌。该菌的抵抗力较强，能在粪便、灰尘及水中能存活较长时间，苍蝇可携带该菌并保持传染性达5 d以上，因而认为苍蝇为该病的重要传播媒介。根据该菌荚膜抗原的不同可将其分为35个血清型(1～34型及1/2型)[1]，其中2型流行性最广、致病性最强。实验证实，S.suis的荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外因子(EF)、溶血素、黏附素、谷氨酸脱氢酶及纤连蛋白结合蛋白等在该菌的致病过程中起重要作用[2]。生猪屠宰、销售及肉制品加工人员为本病的易感人群，在接触被感染的病猪后，该菌可经破损皮肤、粘膜或经消化道侵入人体，并引起人链球菌中毒性休克综合征(STSS)和链球菌脑膜炎综合征(SMS)[3]。STSS和SMS发病急、进展快、死亡率高，有些患者虽经治疗后保住性命，但可能导致永久性耳聋等后遗症的发生。

人感染猪链球菌病作为一种新发传染病，对人类的生命健康构成重大威胁，也对社会的生活秩序、经济发展造成严重负面影响。1998年，江苏省曾暴发人感染2型猪链球菌病疫情，导致25人感染，14人死亡。2005年7月，四川省部分市县发生疫情，205人感染，37人死亡[4]。我国已将其与布鲁氏菌一起定为II类动物疫病。由于该病影响严重，对该类病原体的早期诊断显得尤为重要。目前，针对该病原体的常见实验室检测方法包括微生物检测法、免疫学检测法、分子生物学检测法及动物实验法等。

1微生物学检测法

S.suis为需氧或兼性厌氧菌，对营养要求较高，普通培养基上生长不良，在厌氧肉汤中生长良好。患者在应用抗生素治疗前，以无菌方法抽取患者血液或脑脊液，接种于增菌培养基中于37 ℃进行增菌。当仪器显示阳性后，立即将培养物转种于血平板并继续培养。典型的S.suis在血平板上为α-溶血、针尖大小、圆形、露珠状、半透明菌落。革兰氏染色后多为单个或成双排列，少数呈短链状的阳性球菌[5]。该菌触酶实验为阴性，乳糖、蔗糖、甘露醇、纤维二糖、水杨素、七叶素、甘油和山梨醇水解均为阳性，6.5%NaCl中生长呈阳性。若采用API 20 Strep进行快速鉴定也可以满足初筛要求，2型S.suis的典型生化反应编码为0641453或0641473，鉴定率可达为99.9%[6]。由于S.suis不同血清型或同一血清型的不同菌株间生化反应有较大差异，故单独依据菌体及菌落形态、培养特性和生化表型等特征只能作为筛查性鉴定方法，不能很准确地对该菌进行鉴定。

2免疫学检测法

由于S.suis的生化反应差异较大，传统分离培养及生化鉴定技术难以将其准确分类，因此，免疫学方法在该菌的鉴定上显得尤为重要。目前S.suis的免疫学诊断方法较多，其方法上多以S.suis的毒力因子等为靶位，包括溶菌酶释放蛋白(Mu-Ramidae-Relased Protein, MRP)、细胞外蛋白因子(Extracellularfactor, EF)、溶血素(Suilysin, SLY)、荚膜多糖(Capsularpolysaccharide, CPS)、IgG结合蛋白等，采用免疫荧光技术、毛细沉淀试验、协同凝集试验、凝胶内凝集试验、ELISA技术和Western Blot技术等对培养物进行检测[7]。目前已建立了一些针对CPS、MRP和EF的免疫学检测方法。

Charland等[8]制备了两株CPS缺失变异株，发现CPS是2型菌株的一种重要的致病因子。黄毓茂等[9]采用高压法代替酸热法提取抗原并对广东地区的分离株进行了鉴定，首次证实了2型S.suis在我国的存在。1991年, Kataoka等[10]以菌株D-282的培养上清液为免疫原(主要含有S.suis的MRP和EF)，制备了兔源性多抗和鼠源性单抗，并采用Western Blot的方法成功鉴定了表型为MRP+EF+、MRP+EF-和MRP+EF的菌株。由于Western Blot不适用于大规模的流行病学调查，研究者又于1993年建立了双抗体夹心ELISA技术用以区分致病性和非致病的2型S.suis。2001年，欧瑜等[11]提纯并分离了菌株HA9801的MRP和EF，在制备抗体后建立了适用于流行病学调查的Dot-ELISA和间接ELISA检测方法。Serhir等[12]利用双抗体夹心ELISA检测了S.suis的1、2、1/2、3和22型菌株，该检测方法的特异性为97.6%，敏感性为62.5%，结果与标准检测方法一致。可见，ELISA是一种很好的S.suis亚型鉴定方法。

目前国内尚缺乏针对S.suis的标准诊断血清，国外的标准血清种类较少(仅有A、B、C、D、E、F、G 7种)，不能满足对S.suis诊断的需要。传统免疫学方法中，玻片凝集试验简单、快速，但容易出现假阳性；琼脂扩散特异性强，但敏感性稍差，仅适用于大量样品的鉴定；毛细管沉淀试验特异性好，但血清用量较大[13]。ELISA法特异性强、敏感性高，结果判读方便等，适用于大规模普查，尤其是间接ELISA，该方法需要的血清量较少，优点尤为突出。但这些方法只能鉴别出致病和非致病菌株，要进一步区分出菌株致病性的强弱还需借助Western Blot技术[14]。尽管免疫学方法在对S.suis的检测中有明显的优势，但仍有相当比例的菌株不能定型，因此上述免疫学检测手段仍待于进一步完善。

3分子生物学检测法

分子生物学方法是进行S.suis鉴定及流行病学调查的有效方法，该方法不仅可以高效地检测S.suis的存在，还可以特异地鉴定菌株的血清型。目前较为成熟的S.suis分子生物学检测方法包括PCR技术、脉冲场凝胶电泳法、限制性片段长度多态性分析和随机扩增核酸片段多态性分析技术等[15]。

3.1基于荚膜多糖基因的PCR鉴定法由于荚膜多糖是S.suis的35个血清型鉴别的直接依据，Simth等[16]针对该菌的主要致病株荚膜基因设计了3对引物(cps2J、cpsll和cps9H)建立了血清型特异性PCR的检测方法。该方法可对2型、1/2型1型、14型以及9型S.suis同时进行检测。silva等[17]根据gdh、cps(l、2、7、9)基因序列设计了可对S.suis同时进行鉴定和分型的引物。Okwumabua等[18]根据2型菌株的gdh基因序列建立了S.suis定群PCR，能特异性地检测不同组织器官和地域中所有S.suis菌株的血清型。倪艳秀等[19]根据cps 2J合成了1对可扩增675 bp目的片段的引物，并进一步验证了方法的特异性和准确性。

3.2基于MRP的基因和EF基因的PCR鉴定法

1992年Hildee和Vecht得出了S.suis的完整的mrp基因序列以及侧翼序列，何孔旺等[20]、马清霞等[21]依据该序列合成了引物，建立了能同时检测2型S.suis及其重要毒力因子溶菌酶释放蛋白和胞外因子的多重PCR方法，该方法的特异性强、敏感性高、准确性好。林祥梅等[22]建立了直接从生物标本中检测2型S.suis毒力因子mrp基因和ef基因的多重荧光PCR检测方法，该方法有效地弥补了传统方法的不足，并且进一步提高了鉴定效率和准确性。3.3其他分子生物学检测法Okwumabua等[23]采用RFLP法发现了一个长约1.8 kb的条带，并认为此条带可以对大多数S.suis菌株进行准确鉴定，并证明采用RFLP能有效区分传统免疫学及生化鉴定手段不能区分的S.suis分离株。Forsman等[24]利用16S～23S之间的序列鉴定了由S.suis引起的乳房炎病例。此外，原位分子杂交技术、基于分子伴侣(cpn60)基因、谷氨酸酷脱氢酶蛋白(GDH)等的检测方法也已逐步应用到了对S.suis的检测中来[25]。

分子生物学检测技术以其特异性强、灵敏度高、准确度好的特点，在本病的诊断上有着无可比拟的优势，但由于其敏感度高，存在易污染的风险，故传统的PCR技术在临床上也较少应用[26]。荧光定量PCR及荧光原位杂交技术的兴起弥补了这一不足，但此类方法成本较高、需要特殊检测仪器、方法的灵敏度也有待于进一步提升[27]。

4动物实验检测法

对2型S.suis而言，其致病性的确定一直是个难题。何家惠等[28]在以家兔为模型研究S.suis的毒力时，发现分别通过静脉、肌肉及皮下接种菌株均可致家兔发病并至败血型死亡。最短死亡时间为12 h，并伴有典型神经症状。Kataoka 等[29]用小鼠作为2型S.suis的动物模型，认为BALB/c和SS小鼠较C57BL/6、ICR、BddY小鼠更易感。吴全忠等[30]采用江苏分离株HA9801感染豚鼠并建立了动物模型，发现其发病规律和可重复性较好，而且皮下接种比腹腔和鼻腔接种更易引起脑膜炎，因此他们认为豚鼠可作为2型S.suis毒力检测的较好的动物模型。

由于人猪链球菌病发病急，进展快，动物实验在临床工作中难以发挥较大作用，因此动物实验多仅局限地应用于科研领域。

5展望

猪链球菌病为国家规定的二类人畜共患传染病，临床上以败血症型和脑膜炎型人猪链球菌病较为常见。由于该病在发病早期即可出现中毒休克症状并引起多脏器功能衰竭、疾病发展迅速、病情严重，严重威胁人类健康。因此对本病的早期诊断成为延长患者生存期的关键因素，随着病原学检测技术的不断发展，对本病的检测手段已从传统的分离培养、生化鉴定时代过渡到了分子生物学技术检测时代，PCR、RFLP、荧光原位杂交等方法正逐步运用于临床。随着分子生物学技术的日益发展，我们期待将会有更高效、特异、灵敏的检测手段应用于临床，为患者的诊断及治疗争取到更多时间。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.014

中图分类号：R378

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)05-490-04

收稿日期：2015-07-18修回日期：2015-12-19

Research advances in clinical laboratory diagnosis ofStreptococcussuisinfection

LIU Hai-zhu1，YUAN Xiao-ming2

(1DepartmentofClinicalLaboratory,WeihaiMunicipalHospitalAffiliatedtoDalianMedicalUniversity,Weihai, 264200China；2HushanAnimalHusbandry&VeterinaryStation，Rongcheng,Shandong, 264300China)

AbstractStreptococcus suis(S.suis) is an important pathogen of zoonotic infectious diseases. Once human being suffered from S.suis, it will cause severe meningitis, septicemia, sometimes even cause death. Many related reports have been covered since Streptococcus suis serotype 2 was found to cause serious infection in human being for the first time in 1968. It is a rapid-developing critical disease with a high mortality and has nonspecific clinical symptoms at the early stage. An outbreak of people infected with S.suis in Ziyang and Neijiang of Sichuan Province from June to August 2005 had aroused extensive attention. S.suis is not only greatly harmful to culturist, but also underlying dangerous to public health security, so timely and early diagnoses have become the key question to control the prevalent of S.suis. At present, the common laboratory detection methods include microbial detection, immunoassay, molecular biological test and animal experiment method. This article reviews progress in the research of laboratory diagnosis of human infected with S.suis.

Key words：Streptococcus suis； zoonotic pathogen； laboratory diagnosis