骨髓间充质干细胞在心肌组织工程中的研究与进展

孙国栋 郭光伟

（山西医科大学，山西 太原 030001）



骨髓间充质干细胞在心肌组织工程中的研究与进展

孙国栋 郭光伟

（山西医科大学，山西 太原 030001）

【摘要】骨髓间充质干细胞因其具有高度增殖能力，多向分化潜能等优点已经引起了人们对骨髓间充质干细胞的研究热潮，尤其是做为组织工程及心血管疾病细胞移植治疗的理想种子细胞方面。常规用于房间隔或室间隔缺损修补手术的补片为涤纶补片，它具有质量轻、质地薄、生物相容性较好等优点，但近几年发现，用其修补后，如若发生术后残余漏，较易引起溶血、真菌或细菌感染。因此利用骨髓间充质干细胞的多向分化潜能在体外构建一种含有类心肌样细胞具有生物活性的补片是目前亟待解决的问题。但骨髓中的间充质干细胞含量极低，需经体外分离，纯化，扩增并吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，然后将其复合物植入机体组织或器官病损部位，才能达到修复缺损心肌和梗死后心肌组织的目的。

【关键词】骨髓间充质干细胞；组织工程；心肌样细胞

随着科学技术的发展，组织工程的兴起，骨髓间充质干细胞（BMSCs）在组织工程学中作为种子细胞使用也越来越受到人们的关注。骨髓间充质干细胞来自于中胚层，于全身结缔组织和器官间质中均存在，但含量极少［1］。相比较而言，BMSCs在骨髓中的含量最多，为骨髓中的非造血干胞，对骨髓中的造血干细胞有机械支持作用，也可以分泌许多生长因子（如ILIF、L-11、IL-6、M-CSF及SCF等）支持造血。所以获得生长状态良好、较纯化和足够数量的BMSCs是组织工程研究实验的基础。人们在研究中发现BMSCs对塑料培养材料的贴壁特性，过去又被称为塑料贴壁细胞。它体外培养增殖较为容易，同时还具有无免疫原性和多向分化的潜能。在一定的体外环境下可以分化成为心肌样细胞，本文就BMSCs诱导成心肌样细胞研究进展做如下综述。

1 研究背景

随着人们生活节奏的加快，生活方式的改变，心血管系统方面的疾病呈逐年增长的趋势。但心肌细胞是不可再生细胞，现有的医学手段也只能从营养心肌细胞，降低心肌氧耗来改善心脏功能。因此寻找一种能替代坏死心肌细胞的新的种子细胞成为我们的迫切需求。骨髓间充质干细胞（BMSCs）最原始的命名为骨髓基质成纤维细胞，它属于成体干细胞，主要来源于中胚层，可在体内外分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞，心肌样细胞等。1995年，Wakitani等［2］首先证实骨髓间充质干细胞在体外经5-氮杂胞苷诱导后分化成心肌样细胞，分化率约为30%。引起了对骨髓间充质干细胞的研究热潮。屈佳等［3］体外模拟心肌环境用心肌细胞冻融液诱导MSCs向心肌细胞分化发现：在心肌细胞冻融液的环境中培养的MSCs，细胞生长旺盛，有大量子代形成。同时还发现心肌细胞冻融液可将具有多能分化潜能的MSCs诱导为包括心肌细胞、血管内皮细胞在内的一个细胞群体，与5-Aza单一的心肌细胞诱导作用相比，更能提供一个适合心肌再生所需的自然条件。Kadner［4］等以成人BMSCs为种子细胞，进行体外扩增，然后进行基因修饰借助于生物材料载体将其回植入体内，可用于心血管组织工程。Krupnick等［5］将鼠BMSCs种植在三维支架上，并将细胞－支架复合物移植在同系基因型鼠的左心室，研究结果表明，BMSCs种植在三维细胞支架上有向心肌分化的潜力。

2 BMSCs的分离方法

2.1 全骨髓贴壁法：这是骨髓间充质干细胞最早的分离方法，将抽取的骨髓直接加入培养液制成细胞悬液，以合适的细胞浓度进行接种培养，它是利用BMSCs对塑料底的贴附性，定期换液去除悬浮生长的造血系细胞，进行分选纯化而得。这种方法得到的BMSCs形态多呈梭形、呈集落生长，而且成分复杂，均一性差，抗原特异性差异也较大。

2.2 密度梯度离心法：根据骨髓中细胞成分的比重不同，能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来，然后将分离出来的骨髓间充质干细胞进行贴壁培养。这类细胞同源性更强，且有更强的自我更新能力和多向分化潜能，同时操作简便、快速，对细胞的活性影响较小。

2.3 流式细胞仪分离法：不同种类细胞都有其自身特殊的细胞标志并且其体积大小也不同，将分理出的细胞与有荧光标记的特异性抗体相结合，制做成特定浓度的细胞悬液，放入流式细胞仪机器中，然后经激光照射，发出的荧光信号将被转化成电信号，再由计算机对其进行处理，这样就把阳性表达的细胞与阴性表达的细胞分离开了。

2.4 免疫磁珠分离法：将BMSCs的表面特异性抗原与连接有磁珠的特异性抗体相结合，形成带有磁珠的，抗原-抗体免疫复合物，在外加磁场磁力作用下带有磁珠的细胞将停留在磁场中，未带磁珠的细胞则离开了磁场，从而使细胞分离。

后两种方法分离的细胞纯度较高，但价格昂贵，对细胞的活性影响也较大，甚至导致细胞完全失去活性，目前较少应用。

3 BMSCs体外扩增的微环境

3.1 胎牛血清培养法：胎牛血清是目前干细胞培养中常规应用的添加剂，但其有感染病毒或细菌的潜在风险，此外胎牛血清培养后的细胞含有异体蛋白，并且扩增后也难以清除，Spees等［6］证实应用胎牛血清扩增获得的108个骨髓间充质干细胞含7～30 mg胎牛血清蛋白，可引起免疫反应。

3.2 自体血清培养法：Mizuno等［7］使用人自体血清代替胎牛血清，实验也证明自体血清微环境更适合体外培养骨髓间充质干细胞，它能促进BMSCs增殖，缩短传代时间，维持细胞的稳定，减少细胞自发分化等优点。

3.3 脐血血清培养法：脐血血清含有多种细胞因子，可促进BMSCs的增殖、分化；并且具有采集方便，来源广泛，对母亲及胎儿无影响，巨细胞病毒、EB病毒污染率低，无伦理限制等优势。Lam等［8］使用自体脐血血清扩增自体脐血干细胞，旷文勇等［9］使用脐带血血清替代胎牛血清的DMEM/F12培养法，雷晓宇等［10］发现骨髓间充质干细胞在较低体积分数脐血血清中增殖能力良好。这些实验也都足以说明脐血血清培养法可做为一种安全有效的培养法应用于临床。

4 BMSCs诱导分化为心肌样细胞的研究

4.1 诱导分化的方法及相关诱导因素

4.1.1 化学诱导剂：①5-氮胞苷：尽管胞嘧啶类似物5-Aza的诱导作用已获得肯定，但5-Aza具有细胞毒性则限制了其应用，因此寻找更加安全有效的诱导剂成为当前备受关注的课题之一。②血管紧张素Ⅱ：AngⅡ是一种肽类激素，它可诱导BMSCs向心肌样细胞分化，其诱导作用可能与浓度，细胞信号转导通路有关。它同时具有调节代谢，刺激血管平滑肌增殖，调节血管张力的作用。Li等［11］研究证实，AngⅡ刺激BMSCs增殖的作用是通过与受体结合，引发多条信号通路激活使细胞活化，其中最重要的是其激活有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路并发生酪氨酸磷酸化而活化细胞外信号调节激酶（EPK）而产生的。③骨形态发生蛋白-2：BMP-2是转化生长因子β超家族中的一员，它可调节多种细胞生长、分化和凋亡。王新艳等［12］研究发现，BMP-2介导Smad通路的磷酸化及向细胞核转位过程，从而在BMSCs向心肌细胞的分化过程中发挥诱导效应。④丁酸钠：董亮等［13］研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠能够有效诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，其机制可能与抑制组蛋白去乙酰化酶活性，增强组蛋白的乙酰化，进而激活相关沉默基因，促使其表达有关，因组蛋白乙酰化是诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的机制之一。

4.1.2 心肌微环境：①心肌组织裂解液：李琴等［14］用心肌组织裂解液人工模拟心肌生长的微环境，对BMSCs定向诱导。得到的结果证明诱导后的细胞呈明暗交替排列整齐的肌丝样结构，同时也发现了具有自律性搏动的多核肌管结构。②心肌细胞共培养：Pijnappels等［15］将心肌细胞混合乳鼠BMSCs进行共培养诱导，获得的细胞有心肌细胞的功能活性，但大龄鼠BMSCs无法得到具有功能活性的心肌细胞。因此可以得出在诱导干细胞分化的过程中不但外部的诱导环境非常重要，同时实验对象的年龄，细胞的活力和其自身的形态都有关系。

4.2 分化为心肌样细胞的鉴定方法

4.2.1 形态学鉴定：①在高倍显微镜下观察细胞的形态：如细胞外形是否向心肌样衍变，细胞是否形成肌管，细胞是否跳动等。②在电子显微镜下观察细胞的超微结构：如定向诱导后的骨髓间充质干细胞是否具有心肌样细胞的超微结构，如呈梭形样的细胞，其细胞核位于细胞的中央，胞质内可见糖原颗粒和线粒体结构等。

4.2.2 免疫组化鉴定：①表达心肌细胞的特异性标志：a.结蛋白、α肌动蛋白：作为心肌细胞分化的早期标志物，结蛋白与和α肌动蛋白得到了广泛的认可。目前用来检测心肌细胞使用次数最多的特异性指标。b.肌钙蛋白：具有较高特异性的cTnI，作为心肌损伤的检测和心肌源性细胞鉴定的特异性生化标志物，其阳性表达说明BMSCs发生心肌转化白。c.间隙连接蛋白43：Cx43在细胞间电冲动的传导，维持细胞间电活动和收缩、舒张功能的同步性，心肌功能的保持和细胞间化学信号的交流，都很重要，是心肌闰盘检测的常用指标。贾敏等［16］在研究BMSCs提取扩增及向心肌细胞诱导的过程中，cTnT和Cx43表达阳性，表明诱导分化的细胞有心肌细胞的特性。d.肌细胞增强子2C：肌细胞增强子2C（MEF2C）作为心脏特异性的因子在心脏发育的过程中均参与、调解心脏特异性基因的表达，MEF2C有显著的组织特异性。e.超极化激活的核酸环：超极化激活的环核苷酸门控的离子通道（HCN）是编码起搏电流的离子通道，同时由于HCN和心脏起搏的产生和调节密切相关，因此又被称作起搏基因。HCN编码的起搏电流具有超极化激活，对钠钾离子均具有通透性，可被细胞内的cAMP调节，具有微弱的单通道电导等独特特征［17］。HCN的表达在窦房结中依次为HCN4＞HCN2＞HCN1。因此，可以通过检测HCN4、HCN2和起搏电流判定BMSCs是否分化为心肌细胞。f.肌球蛋白重链：已知哺乳动物的心脏表达两种肌球蛋白重链（MHC），即α-MHC和β-MHC。β-MHC蛋白水平能够在一定程度上反映BMSCs向心肌细胞的分化情况，其基因表达水平是观察BMSCs向成熟心肌样细胞分化的重要指标之一。②β半乳糖酐酶基因转染细胞标记技术：将β半乳糖酐酶基因通过复制缺陷重组胰病毒为载体转染至待移植培养的骨髓干细胞。通过检测宿主心脏中的β半乳糖酐酶的活性，即可定性和定位移植干细胞是否分化增殖为心肌细胞。③Y染色体荧光原位杂交技术：运用该技术鉴定移植干细胞的前提是选用雌性动物为受体，同时移植的骨髓干细胞来源于雄性动物，如果雌性受体动物心肌检测到Y染色体，则可以证明骨髓干细胞已分化增殖为心肌细胞。

4.2.3 电生理学鉴定：目前遇到分化出来的心肌样细胞的电生理特性的研究尚不多见，虽然一些对细胞的动作电位的特点进行了描述，但对细胞膜上的钠、钾、钙、氯等离子通道的特异性研究在国内外的文献报道较少。

5 存在的问题及展望

近年来骨髓间充质干细胞因具有易获得，易增殖，易被诱导分化，不存在道德伦理问题，移植后无免疫排斥反应等优点。它已被作为种子细胞广泛的应用于骨，软骨，心肌等组织工程的研究中，并且已经取得了一定的发展。但在一些领域的研究尚处于探索阶段，还有如下一些问题需要解决。

5.1 BMSCs的鉴定问题：虽然BMSCs分化为心肌样细胞的心肌特异性鉴定指标的研究取得一定成果，但仍有许多问题需要解决。如BMSCs表面的多个细胞表面标志物大多缺乏特异性，因此在BMSCs的鉴定方面的仍需进一步的研究。

5.2 BMSCs的诱导问题：BMSCs增殖，分化的控制需要合适的条件，如何既能控制增殖，又可以避免肿瘤细胞形成，同时又能在合适的条件下取得所需的分化途径，还有待进一步的研究。

5.3 对BMSCs离子通道的研究：从结构蛋白的表达到功能蛋白的表达之间存在着复杂的调控机制，可能与细胞分化的方向和程度密切相关。BMSCs仅表达外向钾电流，未表达内向的快钠电流，说明其尚不足以完成心肌细胞的兴奋与传导功能。

参考文献

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中图分类号：R54

文献标识码：A

文章编号：1671-8194（2016）03-0041-03