脱钙骨基质复合自体MSCs修复兔关节软骨缺损的实验研究

刘长铁　刘兵兵　晏小荣

摘要：目的 探讨脱钙骨基质复合自体骨髓间充质干细胞（MSCs）修复兔关节软骨缺损的方法。方法 ①选择新西兰大耳白兔24 只，双下肢髁关节面上共制作3个直径 3 mm、深3 mm 的全层软骨缺损， 自左到右为：空白对照组（A组）， 脱钙骨基质（B组），脱钙骨基质复合自体骨髓间充质干细胞（C组）；②分别于术后 4，8，12 w各处死8只，应用大体观察、组织学观察及组织学评分评估缺损软骨的修复情况。结果 脱钙骨基质复合自体骨髓间充质干细胞组术后 12 w、组织切片显示新生组织中可见大量类透明软骨细胞出现，修复组织和周围软骨整合良好。C组各个时间点组织学评分均高于其他两组（P<0.05）。结论 脱钙骨基质复合自体骨髓间充质干细胞提高了对兔关节软骨缺损的修复效果。

关键词：脱钙骨基质；关节软骨；自体；骨髓间充质干细胞

组织工程学的发展给关节软骨损伤的修复带来了生物学治疗的美好前景。本实验在前期成功将自体间充质干细胞体外分离的基础上，将之与可降解生物材料脱钙骨基质在体外短暂复合， 然后移植修复兔关节软骨缺损，以探讨一种实用的关节软骨缺损组织工程修复方法。

1 资料与方法

1.1脱钙骨基质材料的制备 将新西兰大耳白兔处死后，取其骼骨，剔除骨膜、软骨及软组织，反复冲洗清除骨髓、血污及表面油脂，制备成4.0mm×4.0mm×3.0mm的条块状。

1.2方法 同一兔中双下肢髁关节面上共制作3个直径3mm、深3 mm的全层软骨缺损，自左到右为：自左到右为：空白对照组（A组），脱钙骨基质（B组），脱钙骨基质复合自体骨髓间充质干细胞（C组）。查随机数字表将24只大白兔随机分为4、8 w和12 w三组。

1.3动物模型制做 做动物模型主要分为以下几点：①术区备皮，手术者将兔取仰卧位，进行双下肢备皮，常规消毒铺巾。用3 mm的钻头在右股骨内外髁左股骨内髁造出直径0.3cm、深度为0.3 cm全层厚软骨缺损模型；②材料植入，彻底止血，用生理盐水冲洗创口；③动物在相同条件下饲养。

1.4观察指标 ①动物术后的具体情况；②关节面的修复情况；③缺损区新生组织组织学观察及组织学评分（Wakitani评分）。

1.5统计学方法 组织学评分数据均记作（x±s），根据标准差单向方差分析用SPSS 16.0软件进行统计处理， 比较各组评分与正常值均数间的差异，α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1大体观察 C组：术后12 w修复区表面平整光滑，与周围正常软骨难以区分，色泽为瓷白色。B组：术后12 w外观略有凹陷，色泽与周围组织接近但仍可区分。A组：术后12 w缺损仍明显，可见肉芽组织部分充填缺损。

2.2组织学观察 C组：12 w后细胞体积较大数量较多，可见柱状排列，与周围正常软骨组织相近，修复组织和周围软骨整合良好，TB染色为阳性。B组：12 w后HE染色可见短小卷曲的胶原纤维和软骨陷窝样结构，细胞排列不规则，TB染色为弱阳性。C组：12 w后缺损仍存在，缺损底部可见纤维组织充填部分缺损，TB染色为阴性。

2.3组织学评分 见表1。

表1结果表明， A组4、8、12 w评分值与C组相应时刻评分值比较差异显著（P<0.01）；A组4、8、12 w评分值与B组相应时刻评分值比较差异显著（P<0.01）；B组4、12w评分值与C组相应时刻评分值比较差异显著（P<0.01）。

3 讨论

骨性关节炎（OA）是一种严重危害中老年人健康的退行性疾病，随着老龄社会的到来，OA的发病率以惊人的速度逐年增长，据相关资料统计，在50岁以上的人口中，其发病率仅次于心脏病而居第2位，给越来越多的患者带来了肉体乃至精神上的痛苦和经济上的负担，其病理特点为关节软骨变性、破坏、软骨下硬化，关节边缘和软骨下骨反应性增生、骨赘形成。所以，关节软骨治疗是OA治疗的关键，关节软骨由于缺乏血管分布，当缺损直径超过3 mm时，不但自身再生修复能力有限，还可继发周围软骨的退变，最终出现严重的骨关节炎和关节功能明显受限。目前临床治疗关节软骨缺损的方法很多，但没有公认最优的能实现长期透明软骨修复的方法，组织工程技术是再生修复关节软骨缺损最具有潜力的方法之一。骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中来源于中胚层、具有很强的增殖能力和多向分化特性的未分化的干细胞[1]。在不同诱导环境下，它可分化成为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等， 并且这些细胞之间具有相互转化的能力[2]，vanosch、zhou、Cao等[5]发现钙骨基质具有成软骨能力，可以诱导干细胞向软骨细胞分化。

本实验在前期实验基础上，将骨髓间充质干细胞体外分离与脱钙骨基质短暂复合后移植入缺损关节处提高其修复效果，获得了较为理想的实验结果。初步观察结果显示，术后第4 w，脱钙骨基质复合自体间充质干细胞复合物植入缺损，修复面较平整；到第8 w时修复组织与周围组织融合良好，修复表面平整；术后第12 w修复面平整光洁。

本实验探讨了用利用密度梯度离心原理对骨髓血进行快速细胞分离提取MSCS作为种子细胞复合脱钙骨基质支架材料移植用于修复实验性关节软骨缺损的实验方法，在国内外报道不多，并取得了较好的实验效果，为临床关节软骨损伤的生物学治疗提供了一个新的思路。

参考文献：

[1]Minguell JJ，Erices A， Conger p. Mesenehymal stem cells[J].ExP Biol Med，200l，226（6）： 507-520.

[2]Han J，Chen R，Chen H，et al. Growth and ostogenesis characteristics of cultured rat marrow stromal cells under bone induction condition[J]. J Wcums， 2001，32（2）：235-239.

[3]Van Oseh GJ， ten Koppel PG，van der Veen SW， et al. The role of trabecular deminerlized bone in combination with perichondrium in the generation of cartilage grafts[J]. Biomaterials， 1999，20（3）：233-240.

[4]Zhou S，Yates KE，Eid K，et al Deminerlized bone prornotes chondrocyte osteoblastDifferentiationtiat of human marrow stromal cells cultured in collagen sponges[J]. Cell Tissue Bank，2005，6（1）：33-44.

[5]Gao J，Knaack D，Goldberg VM，et al. Osteochondral defect repair by demineralized cortical Bone matrix[J].Clin orthop Relat Res，2004（427 Suppl）：S62-66.編辑/金昊天