骨髓间充质干细胞移植联合吡菲尼酮治疗肺间质纤维化的研究

陈侃

【摘要】 目的 探讨吡菲尼酮（PFD）联合骨髓间充质干细胞（MSCs）移植入博来霉素（BLM）诱导肺纤维化小鼠的疗效。方法 36只健康清洁级体重200 g雄性SD大鼠， 随机分为6组， A组为阴性对照组、B组阳性对照组、C组单纯激素治疗组、D组单纯MSCs移植组、E组单纯PFD治疗组、F组PFD联合MSCs移植组， 各6只。 SD大鼠体外培养MSCs， 注入BLM制备肺纤维化模型， 观察肺组织形态学变化， 测定转化生长因子（TGF-β1）的蛋白表达。结果 造模7 d后， C、D、E、F组大鼠出现炎症细胞浸润比B组减少， 肺纤维化程度明显减轻， F组较C、D、E组的病理改变更轻， 肺纤维化不明显。肺系数中B组下降明显， 与A组比较差异有统计学意义（P<0.05）。B、C、D、E、F组肺纤维化评分高于A组， 差异有统计学意义（P<0.05）。肺组织中转化生长因子胶原表达的阳性细胞数明显减少， F组较B、C、D、E组数量减少和强度减弱更加明显， A组与B、C、D、E、F组比较， 差异有统计学意义（P<0.05）， C、D、E组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 骨髓间充质干细胞移植联合吡菲尼酮对肺纤维化有一定的抑制作用， 能够降低肺组织转化生长因子的表达， 有修复和再生作用， 治疗肺纤维化效果明显。

【关键词】 吡菲尼酮；骨髓间充质干细胞；大鼠；肺间质纤维化；转化生长因子

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.01.213

特发性肺纤维化（IPF）是由于肺泡上皮的损伤及纤维细胞增殖， 最终形成成纤维细胞灶， 是一种严重的弥漫性肺间质疾病， 发病率和死亡率均较高， 对患者家庭及社会造成严重影响。IPF发病机理不明， 临床症状不明显， 无特效药物治疗， 不能治愈与逆转[1]。传统糖皮质激素等药物治疗作用有限， 寻找一种安全有效、新型低毒抗肺纤维化药物已经迫在眉睫。随着医学科技的发展， 以MSCs移植治疗肺纤维化中有积极的效果， 同时吡啶酮类化合物也能够预防和逆转细胞外基质的产生， 防治纤维化效果良好。本实验就PFD联合MSCs移植对大鼠肺纤维化模型进行干预， 为防治肺纤维化提供实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 动物 选取36只健康清洁级体重200 g雄性SD大鼠， 室温 27℃， 湿度70%， 垫料干燥， 由北京维通利华动物公司提供[动物合格证号：scxk（京）2007-0001]。随机分为6组， A组为阴性对照组、B组阳性对照组、C组单纯激素治疗组、D组单纯MSCs移植组、E组单纯PFD治疗组、F组PFD联合MSCs移植组， 各6只。

1. 1. 2 试剂与仪器 低糖DMEM培养基购自Gibco， 免疫组化试剂盒购自南昌长城生物工程公司， 转化生长因子购自武汉博士德生物工程有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 大鼠MSCs的分离、培养及标记 SD大鼠断颈处死， 无菌分离股骨和胫骨， 暴露骨髓腔， 低糖DMEM培养基冲洗， 收集混浊液即骨髓细胞， 低温离心后弃去上清液， 制成细胞悬液， 计数后接种于培养瓶， 消化传代， 收集第四代细胞用于实验。

1. 2. 2 体内细胞移植 A组， 第1天气管内注射生理盐水2 ml/kg 0.3 ml；B组， 第1天气管内注射0.3 ml BLM 5 mg/kg；C组， 第1天同B组， 第2天， 给予地塞米松 0.5 mg/kg， 连续3 d；D组， 第1天注射BLM 5 mg/kg， MSCs （5×105/200 μl PBS）移植；E组， 第1天注射BLM 5 mg/kg， 0.3 ml， 第2天， 给予吡菲尼酮 0.5 mg/kg， 共7 d；F组：第1天注射BLM 5 mg/kg， MSCs移植， 第2天， 给予吡菲尼酮 0.5 mg/kg， 共7 d。

1. 2. 3 肺纤维化模型制备 使用BLM诱导建立模型， 腹腔麻醉后， 取出肺组织， 称肺湿重， 加入固定液使肺复张， 脱水、透明、固定、包埋， 4 μm厚连续切片， 分为组织诊断学和免疫组化染色使用。

1. 2. 4 肺组织形态学检测 HE染色， 封片， 显微镜下观察肺纤维化修复效果。

1. 2. 5 免疫组织化学法检测 TGF-βl呈颗粒状分布于胞浆中， 以棕色为阳性表达， 颜色越深表达越强。每只大鼠采用3张切片， 15个视野， 测定阳性细胞数。

1. 3 观察指标及评价标准

1. 3. 1 观察指标 观察大鼠的体重、肺湿重， 计算肺系数（肺湿重 mg/体重g）。

1. 3. 2 评价标准 肺纤维化程度采用Szapiel评分法：无肺泡炎计0分；轻度肺间质纤维化， 面积<20% 计1分；中度纤维化， 面积>30% 计2分；重度纤维化， 面积>50% 计3分。

1. 4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验；计量资料采用等级计数资料， 1级计1分。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 病理学表现 A组肺泡结构清晰， 气道上皮光滑， 气道周围无炎性细胞浸润， B、C、D、E、F组肺间质浸润， 肺泡间隔增宽。B组第7天病变程度明显加重， 大量炎症细胞渗出， 肺泡壁结构破坏严重， 第14天炎症细胞渗出减轻， 纤维化程度较轻， 第21天成纤维细胞大量聚集， 肺纤维化广泛出现。C、D、E、F组较B组炎症相对减轻， 第7天出现肺泡壁结构破坏， 炎症细胞渗出， 部分肺泡不张， 第14天多数肺泡复张， 第21天成纤维细胞聚集， 出现轻度肺纤维化。F组较C、D、E组的病理改变更轻， 肺泡基本复张， 肺纤维化不明显。

2. 2 肺系数变化 B、C、D、E、F组体重比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。与A组比较， B组肺系数第7天后均明显下降， 差异有统计学意义（P<0.05）；其余各组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2. 3 肺纤维化程度 B、C、D、E、F组第7天开始高于A组（P<0.05）；B组高于C、D、E、F组， 差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E、F组间差异无统计学意义（P>0.05）。F组肺纤维化严重度分数最低， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2. 4 免疫组化检测结果 TGF-βl表达在B、C、D、E、F组显著高于A组， 差异有统计学意义（P<0.05）。与B组比， C、D、E、F组阳性细胞数均减少， 差异有统计学意义（P<0.05）。C、D、E、F组间差异无统计学意义（P>0.05）。F组较B、C、D、E组数量减少和强度减弱更加明显， 以单个肺泡巨噬细胞出现（P<0.05）。C、D、E组数量略减少， 表达强度略降低（P>0.05）， B、C、D、F组的阳性肺泡巨噬细胞有逐渐减少趋势。见表3。

3 讨论

特发性肺间质纤维化中最常见的是IPF， 预后差， 死亡率高， 至今尚无明确有效的治疗方法[2]。通过建立肺纤维化动物模型， 通过观察肺纤维化发生、发展和转归等规律， 有效诊断肺间质性疾病。SD大鼠种系纯， 体形小、适应性强， 成本低， 易于操作， 是理想的造模选择[3]。IPF主要机制由于肺泡I型细胞广泛损伤， 炎症细胞释放大量细胞因子包括转化生长因子相互作用， 造成成纤维细胞大量聚集， 肺泡Ⅱ型细胞不能及时分化， 修复正常肺组织结构， 最终形成肺纤维化。TGF-βl作用于胶原的转录和翻译过程， 促进胶原蛋白的形成沉积， 增加抗蛋白酶活性， 致ECM在肺内积聚， 肺泡壁增厚， 最终引起肺纤维化和呼吸功能障碍。

成体干细胞在组织受到损伤后， 被激活并分化为所需的细胞， 实现组织修复和再生功能。来自骨髓的间充质干细胞， 可感知损伤信号， 发挥修复和再生的能力；免疫调节功能强大， 能够避免排斥反应；可生成多种细胞因子， 促进血管再生及损伤修复， 分化为心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞和上皮细胞等 [4]， 抗心肌纤维化， 降低肝纤维化等。MSCs能够减轻胶原沉积， 防治靶器官纤维化， 修复器官损伤上具有较高的应用价值。PFD是一种新型抗纤维化药物， 抑制脂质过氧化， 不良反应较低， 毒性小， 减少生长因子、肿瘤坏死因子、转化生长因子的生成， 促进炎症反应降低， 抑制纤维化靶基因转录， 为治疗纤维化疾病意义深远 [5]。

本研究注入生理盐水后， 大鼠气道上皮光滑， 无炎性细胞浸润， 表明建模成功[6]。B组病变程度加重， 出现广泛的肺纤维化；C、D、E、F组炎症及肺纤维化结果较B组减轻， 出现轻度纤维化；F组较C、D、E组的病理改变更轻， 肺纤维化不明显。说明吡菲尼酮联合骨髓间充质干细胞移植可减缓肺纤维化的病理进程， 推测骨髓间充质干细胞移植向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化， 恢复和重建肺泡上皮细胞， 不断替代已破坏的细胞， 抑制炎症细胞的增殖、活化和分泌功能， 具有抗炎作用、免疫抑制作用， 抑制肺纤维化。

免疫组化检测TGF-βl的表达， B、C、D、E、F组阳性表达显著高于A组， 差异有统计学意义（P<0.05）。C、D、E、F组比B组阳性细胞数均减少， 差异有统计学意义（P<0.05）。C、D、E、F组差异无统计学意义（P>0.05）。F组数量减少和强度减弱更加明显（P<0.05）。从B、C、D、E、F组， 有逐渐减少趋势。提示在肺纤维化的发生和发展中， TGF-βl蛋白的表达可能起重要的作用， 纤维化的减轻与细胞因子水平的升高， 对上皮细胞生长有抑制活性， 在低浓度时促进平滑肌细胞、纤维母细胞的生长， 高浓度时抑制生长， 说明了TGF-βl在慢性纤维化过程中具有促进作用， 清除透明质酸， 增殖肺内成纤维细胞， 抑制肺纤维化也有重要作用。

在肺纤维化评分中， B、C、D、E、F组高于A组（P<0.05）；B组分数最高， F组最低， 差异有统计学意义（P<0.05）， 说明吡菲尼酮联合MSCs移植修复肺纤维化的效果最佳。B组比A组阴性对照组肺系数明显下降（P<0.05）， 说明MSCs移植联合吡非尼酮注射后， 可在损伤部位聚集， 修复损伤的肺上皮细胞， 减弱纤维化的程度。吡菲尼酮联合骨髓间充质干细胞移植的抗炎、抗维化作用与阻止TGF-βl水平的升高有关[7]。

综上所述， 通过使用PFD联合MSCs移植治疗特发性纤维化的试验， 证实了PFD联合MSCs移植能够抑制胶原沉积， 逆转肺部分纤维化病理状态， 抑制发生拮抗纤维化， 缓解炎症反应， 促进肺组织修复重建。为饱受恶性肺病困扰的患者带来福音， 具有十分广阔的应用前景， 对有效预防及治疗肺纤维化具有重要的经济和社会意义。

参考文献

[1] 夏诚诚， 宋宇哲， 唐凤娇.骨髓间充质干细胞在放射性肺损伤中的应用前景.中国老年学杂志， 2014， 7（34）：4103-4105.

[2] 黄慧， 李红杰， 徐作军.特发性肺纤维化的药物治疗.临床药物治疗杂志， 2011， 9（6）：40-43.

[3] 宋小莲.骨髓间充质干细胞移植对慢性阻塞性肺病气道及肺实质损伤的修复作用. 第二军医大学， 2009.

[4] 都凌杰， 李冉， 赵曼曼， 等.骨髓间充质干细胞对大鼠硅沉着病纤维化形成的影响.解剖学报， 2013， 44（1）：62-65.

[5] 李萍， 杨秋辉， 王俊岭， 等.吡菲尼酮对牛血清蛋白诱导的肝纤维化大鼠肝损害的保护作用.观察实用肝脏病杂志， 2015， 18（1）：63-66.

[6] 曾省都.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肺纤维化及相关机制的实验. 南昌大学医学院， 2008.

[7] 朱会兴， 高俊玲， 赵曼曼， 等.不同时间骨髓间充质干细胞移植对大鼠矽肺纤维化形成的影响.中国免疫学杂志， 2015（31）： 193-196.

[收稿日期：2015-06-23]