人早孕蜕膜间充质干细胞移植治疗大鼠宫腔粘连*

林鑫子，　黄晨玲子，　罗　新，　帅翰林

(暨南大学附属第一医院妇产科,广东 广州 510632)



人早孕蜕膜间充质干细胞移植治疗大鼠宫腔粘连*

林鑫子，黄晨玲子，罗新△，帅翰林△

(暨南大学附属第一医院妇产科,广东 广州 510632)

[摘要]目的： 探讨人早孕蜕膜间充质干细胞(hDMSCs)治疗大鼠宫腔粘连(IUA)的可行性和有效性。方法: 体外分离、培养、纯化、鉴定hDMSCs。将30只雌性SD大鼠随机分为3组：蜕膜间充质干细胞治疗组(IUA+hDMSCs)、IUA模型组和假手术(sham)组，每组各10只。IUA+hDMSCs组和IUA组复制IUA模型后10 min内，IUA+hDMSCs组经尾静脉注射2×106个Dio标记的hDMSCs，每3天补充1次，连续注射3次；IUA组经尾静脉注射相同容量的PBS；sham组仅行开腹手术。3个动情周期后取子宫行HE染色和Masson染色，测量子宫内膜厚度、子宫内膜腺体数目、子宫内膜小血管数目和纤维化面积比率，并行免疫组化检测子宫内膜组织细胞角蛋白、波形蛋白、转化生长因子(TGF)-β1及整合素αγβ3的表达量，qPCR检测IUA相关基因含量，免疫荧光观察hDMSCs在内膜中的分布情况，并评估大鼠的生育能力。结果:IUA组部分子宫腔闭锁，内膜萎缩，腺体减少，大量纤维化改变。IUA+hDMSCs组与IUA组相比子宫间质厚度明显增加(P<0.05)，大量腺体增生和小血管新生(P<0.05)，纤维化程度减小(P<0.05)，与sham组比较无统计学差异。IUA+hDMSCs组细胞角蛋白、波形蛋白和整合素αγβ3表达量明显高于IUA组(P<0.05)，而TGF-β1表达量低于IUA组(P<0.05)。qPCR结果显示与IUA组相比，除TNF-α和结缔组织生长因子下调外，IUA+hDMSCs组的干细胞因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和thrombospondin-1均明显上调。免疫荧光结果显示Dio-hDMSCs主要分布于腔上皮层，部分位于间质。IUA+hDMSCs组大鼠双侧子宫均妊娠，平均胎鼠数量与IUA组相比有统计学差异(P<0.05)。结论:hDMSCs可在受损的大鼠子宫内膜中存活、增殖，有效修复大鼠的子宫内膜，抑制IUA。

[关键词]人早孕蜕膜间充质干细胞； 宫腔粘连; 大鼠

宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)是由各种因素导致子宫内膜基底层损伤和感染引起的子宫颈管、子宫内膜和子宫肌层粘连，主要表现为宫腔变形、月经失调和不孕综合征[1]。子宫内膜生理性修复是由位于子宫内膜基底层的干细胞不断地增殖分化，形成新的功能层，因此宫腔粘连等子宫内膜修复障碍性疾病是由基底层干细胞源枯竭所致。目前治疗宫腔粘连的方法如宫腔镜下分离粘连组织、人工周期促内膜生长、放置宫腔屏障支架等均不能促使已经损伤枯竭的子宫内膜基底层干细胞再生。人早孕蜕膜间充质干细胞具有自我更新、多项分化能力等特征，可作为治疗IUA的种子细胞。本课题组前期研究发现具有干细胞特性的人早孕蜕膜间充质干细胞(human decidual mesenchymal stem cells, hDMSCs)在生理状态下参与修复受损的子宫内膜，并可在体外诱导分化为子宫内膜组织[2]。本研究拟通过建立IUA动物模型，探讨hDMSCs修复子宫内膜的可行性和有效性，以期为治疗IUA提供新方法。

材料和方法

1实验材料

1.1实验动物SPF级健康雌性SD大鼠40只，鼠龄8～10 周，体重200～230 g，由广东省医学实验动物中心提供，饲养于暨南大学实验动物管理中心SPF级动物房。饲养条件：5只/笼，自由进食水，室温21 ℃～22 ℃，相对湿度(体积分数)40%～70%，噪音低于85 db，通风换气每小时8～12次。

1.2hDMSCs标本来源实验所用蜕膜标本取材于暨南大学附属第一医院妇产科门诊首次妊娠需要行人工流产术的健康女性，孕期为45～60 d，年龄在20～28岁。既往无乙肝、梅毒等传染性疾病，术前未服用米非司酮及其它药物。经医院伦理委员会批准和孕早期人工流产患者知情同意。在施行人流手术时无菌条件下刮取蜕膜组织，立即放入预冷的含有青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，4 ℃保存。

1.3主要实验试剂及仪器小鼠抗人波形蛋白(vimentin)单克隆抗体和小鼠抗人细胞角蛋白18(cytokeratin-18)单克隆抗体购自武汉博士德;兔抗鼠泛细胞角蛋白(pan-cytokeratin)单克隆抗体(Santa Cruz);兔抗鼠转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)多克隆抗体(沈阳万类);兔抗鼠整合素αγβ3(integrin αγβ3)多克隆抗体(Affinity)；浓缩型SABC-CY3 (小鼠IgG)试剂盒(武汉博士德)；DAPI(Sigma)；CM-Dio绿色荧光探针(碧云天)；qPCR引物(上海生工)；荧光倒置相差显微镜(Zeiss)。

2实验方法

2.1hDMSCs的分离和培养以胶原酶联合机械研磨法分离提取hDMSCs[2〗。应用流式细胞仪检测hDMSCs表面标志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105和W5C5的表达。成骨成脂诱导分化检测hDMSCs多向分化能力。细胞免疫组织化学法检测hDMSCs波形蛋白和cytokeratin-18表达情况，鉴定其细胞来源。

2.2hDMSCs的CM-Dio标记取25 mg CM-Dio绿色荧光探针粉末溶于5 mL DMSO中，配置成CM-Dio标记液。取贴壁融合80%的细胞，以5 μL/mL的比例加入标记液，避光于培养箱中孵育30 min，吸弃标记液，更换3次新鲜37 ℃的完全培养基后继续培养。

2.3实验分组及hDMSCs移植将30只大鼠随机分为3组，每组各10只：IUA+hDMSCs组、IUA组和sham组。麻醉大鼠后，常规消毒开腹，挑出双侧宫角，用止血钳夹闭宫角两端，于近卵巢端以4.5号注射器针头将预温至100 ℃的无菌生理盐水注射至宫腔，使宫腔充分膨胀10 s。松开远端止血钳，再以冷的生理盐水冲洗宫腔，关腹。造模成功后10 min内，IUA+hDMSCs组行尾静脉注射2×106个Dio-hDMSCs细胞悬液，此后每隔3天补充1次，连续3次；IUA组行尾静脉注射相同容量的PBS；sham组行开腹手术。

2.4hDMSCs移植后评价hDMSCs移植3个动情周期后处死，行大体观察, 收集双侧子宫组织，部分至于-80 ℃保存。取双侧子宫石蜡包埋, 作子宫横断面切片，行HE染色、Masson染色和免疫组化染色，每张切片随机选择5个高倍视野进行拍照。以Image-Pro Plus 6.0软件对照片进行数据测量：HE染色切片测量各组子宫内膜厚度、子宫内膜小血管数目及子宫内膜腺体数目，取其平均值；Masson染色切片可见蓝绿色子宫内膜间质胶原纤维，测量子宫内膜纤维化面积与子宫内膜间质总面积的比值，取平均值；同时取子宫中段横切面作冰冻切片，荧光显微镜观察移植Dio-hDMSCs在大鼠子宫的存活及分布情况。

2.5免疫组化半定量评估免疫组织化学法行pan-cytokeratin、vimentin、TGF-β1和integrin αγβ3染色，观察范围为包括子宫内膜间质层和上皮层在内的子宫内膜全层，染色阳性为棕黄色颗粒。参考文献[3]方法，在HSI模式下，测定每高倍视野选定某区域的总面积(area)、阳性产物的总积分吸光度值(integrated absorbance,IA)，计算该区域中阳性颗粒的平均光密度值(mean density, MD)，公式为MD=IA/area，每个视野选取5个区域，取平均值。

2.6宫腔粘连相关mRNA表达水平检测将宫腔组织在液氮中进行研磨，提取总RNA；按反转录试剂盒说明书进行反转录，采用荧光定量PCR(quantitive PCR, qPCR)测定相关因子如: 干细胞因子(stem cell factor,SCF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1) 等mRNA的含量，反应体系为：反转录产物2.5 μL，7.5 μmol/L的上、下游基因引物各2.0 μL，qPCR Mix 12.5 μL，加8.0 μL的H2O。PCR扩增条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。qPCR采用2-ΔΔCt法统计分析结果。引物序列如表1。

2.7生育力评估取10只雌鼠行右侧宫腔造模，造模后随机分为IUA+hDMSCs组(尾静脉注射hDMSCs，n=5)和IUA组(尾静脉注射PBS，n=5)2组，每只大鼠的左侧宫腔设为自身对照(n=10)。3个动情周期后雌鼠与雄性SD大鼠3∶1合笼，合笼当日记为孕0.5 d，合笼3 d后分离雌雄鼠，单独饲养孕鼠13 d后处死，观察各组大鼠受孕情况和各组胎鼠的数量。

3统计学处理

使用SPSS 16.0进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用配对t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1hDMSCs的细胞形态及鉴定

hDMSCs形态呈短杆状或长梭状(图1)。流式细胞术检测结果显示，hDMSCs不表达造血干细胞表面标志物 CD34和CD45，强表达 CD29、CD44、CD73和CD105，部分表达W5C5(图2)。hDMSCs可向成骨、成脂方向分化。免疫组化检测hDMSCs表达vimentin，不表达cytokeratin。

Figure 1.The cellular morphology of hDMSCs(×100).

图1 hDMSCs的细胞形态

2各组大鼠子宫大体及组织病理学结果比较

术后各组大鼠均健康活跃，IUA组大体可见子宫形态萎缩硬化，部分子宫上段积水，被大网膜或肠管包裹；HE染色可见宫腔缩窄，子宫内膜腺体减少，部分宫腔闭锁，无正常皱褶结构；Masson染色显示间质组织大量纤维化，符合宫腔粘连病理改变。IUA+hDMSCs组可见子宫与周围组织粘连减轻，HE和Masson染色见子宫内膜较IUA组有大量新生基质细胞和上皮细胞，肌层结构有序，间质层纤维化减轻，厚度近似正常组织，间质内大量新生腺体，与sham组相似，见图3。

Figure 2.The flow cytometry results of hDMSCs.

图2hDMSCs的流式细胞结果

Figure 3.The histopathological examination of endometrium in each group (Masson staining,×40). A: IUA group; B： sham group; C: IUA+hDMSCs group.

图3各组大鼠子宫组织病理学检查结果

3各组大鼠子宫内膜厚度、子宫内膜腺体数量、子宫内膜小血管数量及子宫内膜纤维化程度比较

IUA+hDMSCs组大鼠子宫内膜厚度为(650.33±170.99) μm，略低于sham组， IUA组的子宫内膜厚度为(363.51±235.17) μm，IUA+hDMSCs组及sham组与IUA组的子宫内膜厚度比较有统计学差异(P<0.05)。IUA+hDMSCs组大鼠子宫内膜腺体个数为3.42±0.88，IUA+hDMSCs组与sham组的子宫内膜腺体数量比较无统计学差异，均高于IUA组(P<0.05)。IUA+hDMSCs组大鼠子宫内膜小血管数目为21.90±6.32，近似sham组，前二者均多于IUA组(P<0.05)。IUA+hDMSCs组子宫内膜纤维化面积比率与sham组比较无统计学差异，二者均小于IUA组(P<0.05)，见表2。

*P<0.05vsIUA.

4荧光显微镜下移植细胞在大鼠子宫中的存活及分布

hDMSCs移植3个动情周期后，处死动物，横向包埋并沿长轴切取子宫组织，DAPI染核，制作冰冻切片，于荧光显微镜下观察。子宫中可见绿色荧光hDMSCs，主要分布于子宫腔上皮层，见图4。

Figure 4.CM-Dio labeled hDMSCs in endometrium (immunofluorescence staining,×400).

图4CM-Dio标记hDMSCs在大鼠子宫中的存活及分布

5各组免疫组化4种蛋白水平表达结果比较

Cytokeratin免疫组化结果显示：IUA+hDMSCs组可见大量棕黄色颗粒沉积于柱状上皮细胞胞浆中；IUA组子宫内膜杂乱，棕黄色颗粒沉积于上皮细胞胞浆中，分布不均匀。Vimentin免疫组化结果显示：IUA+hDMSCs组可见棕黄色颗粒沉积于基质细胞和内皮细胞中，腺上皮细胞中未见沉积；IUA组见淡棕黄色颗粒分布于间质中。TGF-β1免疫组化结果显示：IUA+hDMSCs组可见棕黄色颗粒沉积于上皮细胞中，IUA组见大量棕黄色颗粒分布于上皮细胞和间质细胞中。Integrin αγβ3免疫组化结果显示：IUA+hDMSCs组integrin αγβ3主要沉积于上皮细胞中，间质中亦有少量分布；而IUA组中见少量棕黄色颗粒散布于上皮细胞中。IUA+hDMSCs组cytokeratin、vimentin和integrin αγβ3的表达量显著高于IUA组(P<0.05)，但仍不及sham组，而IUA组TGF-β1表达量均高于IUA+hDMSCs组及IUA组(P<0.05)，见表3。

6宫腔粘连相关mRNA表达水平检测

qPCR结果显示，与IUA组相比，除TNF-α、CTGF下调外，IUA+hDMSCs组的SCF、VEGF、bFGF和TSP-1均明显上调(P<0.05)，见图5。

#P<0.05vsIUA；*P<0.05vssham.

Figure 5.Relative mRNA expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIUA.

图5宫腔粘连mRNA表达水平检测

7生育力实验评估

处死孕16.5 d的大鼠，开腹分离子宫，观察各组孕鼠的数量和每侧子宫胎鼠个数。IUA+hDMSCs组和IUA组的左侧宫腔均有胎鼠，且胎鼠数量差异无统计学意义。IUA+hDMSCs组右侧宫腔均妊娠(n=5)，IUA组右侧宫腔妊娠孕鼠数为4只，平均胎鼠数量分别为(6±1)只和(1±1)只，差异有统计学意义(P<0.05)。

讨论

子宫内膜是高度再生的组织，其再生基础是基底层完整。创伤、感染等因素损伤子宫内膜基底层，使基底层部分或完全缺失，丧失周期性功能修复，进而启动纤维性修复导致IUA[1]。目前宫腔镜下粘连分离术是诊疗IUA的金标准，但此法不适用于致密的中、重度IUA，且术后粘连复发率高，尤其对于重度粘连的复发率可达60%[1]。而宫腔支撑物、防粘连生物材料、应用雌激素等方法虽然能在一定程度上预防粘连的复发，但无法促进受损的基底层再生[4]。随着干细胞治疗相关基础理论与临床应用研究的进展，干细胞应用对于此类难治性宫腔粘连具有不可估量的治疗前景[5]。再生医学修复子宫内膜的候选细胞有骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胚胎干细胞以及口腔上皮细胞等[6]。目前已有将自体干细胞移植至重度宫腔粘连患者体内，作为替代疗法后行IVF-ET使患者成功受孕的报道[7]，提示自体干细胞可用于治疗IUA 等子宫内膜修复障碍性疾病。

本研究采用的蜕膜间充质干细胞在胎盘胎膜发育过程中可分泌多种蛋白，并随着孕周增大与绒毛膜细胞共同发育为胎盘，具有强大的增殖能力[8]。本研究采用胶原酶和机械研磨法分离出hDMSCs，流式细胞检测可表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73和CD105，不表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45。W5C5是子宫内膜间充质干细胞特异性的表面抗原，该抗原阳性的细胞相比阴性细胞集落形成能力强，能在体内分化成子宫内膜基质细胞[9]。本研究分离的hDMSCs表面抗原W5C5阳性细胞约为25.23%，提示该类hDMSCs来源于子宫内膜，亦可能具有以上能力，可进一步使用磁珠分选法进行验证。细胞免疫组化结果显示其表达波形蛋白，而不表达角蛋白，进一步提示其来源于子宫内膜。

本研究模拟子宫内膜消融术，采用热水灌注在高温的作用下持续损伤子宫内膜，使组织细胞蛋白凝固坏死，大量上皮细胞脱落于宫腔，以致间质甚至肌层组织裸露，进而产生一系列炎症反应。在内膜修复过程中间质结缔组织异常增生、纤维化，纤维化的间质组织由于缺乏腔上皮的保护作用而相互粘连[10]，从而模拟宫腔粘连。在此条件下，将hDMSCs移植入宫腔粘连模型大鼠体内，3个动情周后观察到IUA+hDMSCs组大鼠子宫与周围组织粘连减轻，形态恢复。HE染色见子宫内膜间质厚度增加，上皮组织覆盖，较IUA组大鼠子宫内膜明显增厚，且小血管数量和腺体数量明显增加。同时hDMSCs通过分泌VEGF促进子宫内膜小血管再生，IGF-1促进上皮细胞和基质细胞再生,逆转IUA无血管化，促进腺体再生。免疫组化结果显示IUA+hDMSCs组vimentin和cytokeratin两种子宫内膜标志蛋白表达量均比IUA组高，SCF上调亦证实了hDMSCs促进子宫内膜细胞增生，修复损伤的子宫内膜组织。

TGF-β与多种器官组织的纤维化密切相关，在IUA的发生发展过程中起着重要作用。研究表明IUA患者的子宫内膜组织中TGF-β表达升高，其表达水平与IUA严重程度呈正相关性[11]。其中TGF-β1是TGF-β家族中比例最大、活性最强的一个亚型，其持续高浓度状态是子宫内膜损伤修复过程中纤维化的主要原因[12]。本研究中免疫组化结果显示IUA+hDMSCs组TGF-β1表达比IUA组低，提示hDMSCs可能通过下调TGF-β1起抗纤维化作用。研究表明TSP-1有活化TGF-β1、抑制血管新生的作用[13]，但本研究中TSP-1上调，可能作为一种调控免疫反应的补偿机制，使组织免受过度损伤[14]。

治疗IUA的目的不仅是促进受损的子宫内膜修复，恢复正常月经周期，逆转纤维化，其最重要的目的是改善患者的生育能力。子宫内膜容受性是子宫内膜允许胚胎着床的重要指标，integrin αγβ3是子宫内膜容受性的标志物之一，在维持胚胎着床和发育中起重要作用。IUA患者integrin αγβ3表达异常，子宫内膜容受性降低，影响囊胚着床，进而导致不孕或流产[15]。本研究中IUA+hDMSCs组integrin αγβ3表达高于IUA组，生育力评估中也验证hDMSCs治疗能提高子宫内膜容受性，稳定囊胚定位、黏附、着床。综上所述，hDMSCs通过分泌相关因子减轻子宫内膜纤维化程度，同时补充枯竭的基底层细胞，增加integrin αγβ3提高子宫内膜容受性，从形态上、功能上参与受损子宫内膜的修复。

热水灌注法建立的宫腔粘连模型并不能确切模拟临床所致的IUA是本研究的不足之处。考虑目前现有研究建立的几乎均为非妊娠期子宫损伤模型[16]，本课题组将进一步改善IUA模型，建立贴近临床实际的妊娠子宫损伤模型，从不同移植途径、体内示踪和分化潜能探索hDMSCs修复子宫内膜的具体作用机制。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Therapeutic effect of first-trimester human decidual mesenchymal stem cell transplantation on intrauterine adhesions in rats

LIN Xin-zi, HUANG Chen-ling-zi, LUO Xin, SHUAI Han-lin

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tluox@126.com;piaoshuai2003@163.com)

[KEY WORDS]First-trimester human decidual mesenchymal stem cells; Intrauterine adhesions; Rats

[ABSTRACT]AIM: To investigate the feasibility and therapeutic effect of transplantation with first-trimester human decidual mesenchymal stem cells (hDMSCs) on intrauterine adhesions (IUA) in rats. METHODS: The hDMSCs were isolated, cultured, purified and identifiedinvitro. Female SD rats were randomly divided into IUA+hDMSCs group, IUA group and sham group. The rats in IUA group were injected with 1 mL PBS via the tail vein, while the rats in IUA+hDMSCs group were injected with 2×106hDMSCs with 3 consecutive injections at every 3-day intervals. The rats in sham group only received laparotomy. The general, histological, and immunohistochemical observations were performed 3 estrous cycles postoperatively. The expression of IUA-related genes was analyzed by quantitative PCR. Immunofluorescence and pregnancy test were also performed. RESULTS: The modeled uteri were of partial atresia and fibrosis, the endometrium was atrophic and the numbers of gland decreased. The endometrium was significantly thicker, the numbers of gland and small vessels increased, and the fibrosis decreased in IUA+hDMSCs group compared with IUA group (P<0.05). The expression of cytokeratin, vimentin and integrin αγβ3 was significantly stronger in IUA+hDMSCs group than that in IUA group, whereas the expression of TGF-β1 was weaker than that in IUA group (P<0.05). The average number of litters in right horns of IUA+hDMSCs group was more than that in IUA group (P<0.05). Except for down-regulation of TNF-α and CTGF, compared with IUA group, the mRNA expression levels of SCF, VEGF, bFGF, IGF-1 and TSP-1 were increased in IUA+hDMSCs group. Dio-labeled hDMSCs mainly located in endometrial epithelium.CONCLUSION: The first-trimester human decidual mesenchymal stem cells survive and proliferate in the rat endometrium and regenerate the endometrium. hDMSC transplantation is a potential novel treatment for IUA and may also be useful to prevent IUA after uterine injury.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1099- 07

[收稿日期]2015- 11- 17[修回日期] 2016- 04- 25

*[基金项目]浙江省科技厅科技计划重大科技专项重大社会发展项目(No. 2012C13015-2)

通讯作者△罗新 Tel: 020-38688857； E-mail： tluox@126.com； 帅翰林 Tel： 020-38688769； E-mail： piaoshuai2003@163.com

[中图分类号]R363； R711.74

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.023