IGF-Ⅱ在肝癌Huh7细胞增殖、迁移与侵袭中的作用*

陈　磊,　 陈埏芳,　高　飞,　黄　卫△

(1广州市中西医结合医院内二科, 广东 广州 510800；2暨南大学附属第一医院消化内科， 广东 广州 510632)



IGF-Ⅱ在肝癌Huh7细胞增殖、迁移与侵袭中的作用*

陈磊1, 陈埏芳2,高飞2,黄卫2△

(1广州市中西医结合医院内二科, 广东 广州 510800；2暨南大学附属第一医院消化内科， 广东 广州 510632)

[摘要]目的： 以胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)为靶点，观察不同表达水平的IGF-Ⅱ对肝癌Huh7细胞生长增殖、侵袭和迁移的影响，探讨IGF-Ⅱ基因在肝癌发生发展过程中的作用，为肝癌的靶向治疗提供新的思路。方法: 分别将构建好的IGF-Ⅱ基因过表达质粒pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ和RNA干扰质粒pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ转染肝癌Huh7细胞，通过real-time PCR及Western blot检测IGF-Ⅱ的表达，采用CCK-8、平板克隆形成、细胞划痕、Transwell小室实验，检测过表达与抑制IGF-Ⅱ对肝癌Huh7细胞生长增殖、侵袭与迁移的影响。结果: 过表达IGF-Ⅱ能促进肝癌细胞的生长增殖及侵袭迁移 (P<0.05)，而抑制IGF-Ⅱ的表达得到相反的结果。结论: IGF-Ⅱ参与调控肝癌Huh7细胞的生物学行为，可能在肝细胞癌的发生发展中发挥重要作用。

[关键词]胰岛素样生长因子Ⅱ； 肝细胞癌

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是对人类构成严重威胁的疾病之一，其全球发病率逐年增长，在肿瘤相关死亡中位居第3位[1]。胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-like growth factor Ⅱ,IGF-Ⅱ)，是一种促胚胎生长因子，现有的研究表明，IGF-Ⅱ在肝癌及癌旁组织中异常过量表达，并与分化程度呈负相关，即分化程度越低IGF-Ⅱ的表达量越高，在肝细胞再生结节、不典型增生、肝纤维化等癌前病变中表达量更高，提示IGF-Ⅱ与肝癌的发生发展密切相关，特别是在肝细胞癌变的早期阶段发挥着重要作用[2-3]，本课题组拟利用前期靶向IGF-Ⅱ基因构建的过表达质粒及RNA干扰质粒，通过脂质体转染肝癌Huh7细胞，在细胞水平上观察IGF-Ⅱ对肝癌Huh7细胞生长、增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响，为寻找肝癌基因治疗的新靶点和新方法奠定基础。

材料和方法

1细胞系

人肝癌细胞株Huh7由广州莱德尔生物科技有限公司提供，常规培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37 ℃、5%CO2的湿润无菌环境中。

2主要试剂与仪器

pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ和pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ由前期实验合成，测序结果与已知序列进行BLAST完全一致；胎牛血清和DMEM培养基(HyClone)；Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen)；SYBRGreenPCRMasterMix(TOYOBO)；BCA法蛋白含量检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司)；CCK-8溶液(Beyotime)。定量PCR仪(ABIPRISM®7500SequenceDetectionSystem)；电泳仪(北京百晶生物科技有限公司BG-Power600i);酶标仪(Thermo)。

3方法

3.1实验分组与细胞转染根据IGF-Ⅱ在肝癌细胞中的表达，分5个组：blank组细胞不进行转染;IGF-Ⅱ对照组转染pcDNA3.1(+)质粒;IGF-Ⅱ组转染pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ重组质粒;siIGF-Ⅱ组转染pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ重组质粒的细胞;siIGF-Ⅱ对照组转染阴性质粒。转染前1d，取对数生长期的Huh7细胞，接种于不同试验需要的培养板中，常规培养至细胞汇合度达80%左右，根据说明书采用Lipofectamine2000 进行转染。

3.2IGF-Ⅱ 表达的real-timePCR检测细胞转染后，按照TRIzol说明书抽提细胞总RNA，进行总RNA纯度和完整性检测后，在PCR仪上完成逆转录得到产物cDNA，并以此为模板，采用SYBRGreenPCRMasterMix进行PCR扩增，IGF-Ⅱ的PCR上游引物序列为5’-CTGGAGACGTACTGTGCTA-3’, 下游引物序列为5’-GACTGCTTCCAGGTGTCAT-3’;内参照18S的PCR上游引物序列为5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物序列为5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。PCR反应条件为95 ℃ 30s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30s，72 ℃ 30s，共40个循环，反应结束后确认real-timePCR的扩增曲线和熔解曲线，每个样品重复3次。IGF-II的mRNA相对表达量用2-ΔΔCt的平均值±标准差表示。

3.3IGF-Ⅱ表达的Westernblot检测细胞转染后，按照蛋白提取试剂盒抽提细胞总蛋白，使用BCA法蛋白检测试剂盒进行总蛋白定量。再进行SDS-PAGE，选择恒压电泳：80V恒压电泳30min，肉眼见到溴酚蓝指示剂跑到分离胶水平后，改成100V恒压电泳直到溴酚蓝刚跑出胶底部便可终止，将凝胶电泳结果转膜至PVDF膜上；孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗进行免疫印记。

3.4IGF-Ⅱ表达对肝癌Huh7细胞生长增殖能力的影响采用CCK-8法进行检测，按照每1×104个的接种量将细胞接种于96孔细胞培养板中，每组细胞设3个复孔，同时设调零孔，每孔体积200μL；将培养板置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育过夜；收集各个时点的细胞(0、24、48、72h)，在避光条件下每孔加入10μLCCK-8溶液，于37 ℃继续孵育4h；酶标仪在450nm波长处测定吸光值即A值；根据同一样品的“增殖率(%)=待测时点A值平均值÷0hA值平均值×100%”公式，并以增殖率为纵坐标、时间为横坐标绘制细胞增殖曲线。

3.5IGF-Ⅱ表达对肝癌Huh7细胞克隆形成能力的影响采用平板克隆形成实验进行检测，分别按照每孔50、100和200个细胞的接种量将细胞接种于96孔细胞培养板中，各设3个复孔，每组总共接种9个孔；将培养板置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养；每天察看，当有细胞克隆形成时即可吸掉各孔的培养基终止培养，PBS缓冲液漂洗2次，每孔加入100μL的甲醇溶液室温下固定15min，然后弃去固定液；每孔加入200μL苏木素染色液充分覆盖皿底染色20min后，自来水冲洗后晾干，计算集落数；使用酶联斑点图像自动分析仪分析、扫描拍照；根据“克隆形成率(%)=克隆数÷接种细胞数×100%”的公式，计算克隆形成率。

3.6IGF-Ⅱ对肝癌Huh7细胞迁移能力的影响采用细胞划痕实验进行检测，将处于对数生长期的肝癌Huh7细胞接种6孔培养板上，置于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养；待细胞融合率达80%时，使用10μL无菌微量移液枪头在细胞板上划横线，尽量用力均匀一致、不要倾斜；用无菌的PBS液沿培养皿的侧壁轻轻地冲洗细胞3次，洗去划下的细胞； 加入不含血清的培养基置于37 ℃孵箱中进行孵育，分别于划痕后0、6、24和48h取样，拍照；Image-ProPlus6.0软件测量各组细胞相同时点任意8个部位划痕宽度，计算细胞迁移率[(0h距离-其它时点距离)/0h距离],以反映各组肝癌细胞运动迁移能力。

3.7IGF-Ⅱ对肝癌Huh7细胞侵袭能力的影响采用Transwell小室实验进行检测，将上室放入下室(24孔板)中，每个上室中加入2滴无血清培养基使膜浸润，放入培养箱中，弃去上室中浸膜用的培养基，每个上室中加入200μL的单细胞悬液(即每室1×105个细胞)，每个下室中加入600μL完全培养基，每组细胞做6个小室，共30个小室；在培养箱中孵育30h后，取出小室，用棉签拭去上室的细胞，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定5min，苏木素溶液染色10min；切去小室膜，置于载玻片上，滴少许二甲苯覆盖，再滴树胶上盖盖玻片；计数，倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞。

4统计学处理

计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS15.0软件处理各组数据，多个样本均数间比较进行方差齐性检验，再做单因素方差分析(one-wayANOVA)，然后两样本均数的比较采用t检验，方差不齐时采用t’检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1IGF-ⅡmRNA在各组肝癌Huh7细胞中的表达

采用实时荧光定量PCR对不同试验组中IGF-ⅡmRNA的相对表达量进行检测，结果发现，IGF-Ⅱ质粒转染组IGF-ⅡmRNA表达显著高于IGF-Ⅱ对照组(P<0.05)；而siIGF-Ⅱ组IGF-ⅡmRNA的表达显著低于siIGF-Ⅱ对照组(P<0.05),blank组与IGF-Ⅱ对照组、siIGF-Ⅱ对照组无明显差异。此结果说明，过表达质粒在细胞中成功转录，在siIGF-Ⅱ组IGF-Ⅱ基因的转录也被成功抑制，见图1。

2IGF-Ⅱ蛋白在各组肝癌Huh7细胞中的表达

用DAB显色法，分别对5组蛋白样品中IGF-Ⅱ蛋白及内参照GAPDH进行检测，结果显示各组中GAPDH表达量基本一致，然而IGF-Ⅱ在5组的表达量存在较大差异。在IGF-Ⅱ组的IGF-Ⅱ表达量显著高于blank组，siRNA组中的表达量显著低于blank组，而IGF-Ⅱ对照组、siIGF-Ⅱ对照组与blank组比较，IGF-Ⅱ蛋白表达水平没有显著差异，见图2。

Figure1.RelativeexpressionofIGF-IImRNAinHuh7cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vsIGF-IIgroup;#P<0.05 vssiIGF-IIgroup.

图1肝癌Huh7细胞IGF-II mRNA的相对表达量

Figure 2.IGF - II protein expression level in Huh7 cells.

图2肝癌Huh7细胞IGF-II 蛋白水平的表达量

3IGF-Ⅱ表达对肝癌Huh7细胞生长能力的影响

采用CCK-8法检测Huh7细胞生长速度的改变，结果显示，从第1天开始，IGF-Ⅱ组细胞A值就显著高于blank组及IGF-Ⅱ对照组(P<0.05)，而IGF-Ⅱ对照组与blank组无明显差异；从第2天开始，siIGF-Ⅱ组细胞A值显著低于blank组及siIGF-Ⅱ对照组(P<0.05)，siIGF-Ⅱ对照组A值与blank组无明显差异，见表1。

*P<0.05vsIGF-Ⅱgroup;▲P<0.05vssiIGF-Ⅱ group.

4IGF-Ⅱ表达对肝癌Huh7细胞增殖能力的影响

采用平板克隆实验，结果显示，IGF-Ⅱ组细胞克隆形成率显著高于blank组及IGF-Ⅱ对照组(P<0.05)，而IGF-Ⅱ对照组与blank组无明显差异；siIGF-Ⅱ组细胞克隆形成率显著低于blank组及siIGF-Ⅱ对照组，而siIGF-Ⅱ对照组与blank组无明显差异，见图3、4。

Figure 3.Colony formation experiment of Huh7 cells.

图3肝癌Huh7细胞平板克隆形成实验

5IGF-Ⅱ表达对肝癌Huh7细胞迁移能力的影响

采用细胞划痕实验检测，结果发现划痕6 h后，与blank组和IGF-Ⅱ对照组相比，IGF-Ⅱ组的迁移能力显著增强(P<0.05)，48 h后划痕已经基本被迁移过来的细胞所覆盖；siIGF-Ⅱ组的Huh7细胞迁移能力则明显下降(P<0.05),见图5、表2。

Figure 4.Colony formation efficiency of Huh7 cells.Mean±SD.n=9.*P<0.05vsIGF-II group;#P<0.05vssiIGF-II group.

图4肝癌Huh7细胞平板克隆率

6IGF-Ⅱ表达对肝癌Huh7细胞侵袭能力的影响

采用Transwell小室实验检测，结果发现IGF-Ⅱ组的Huh7细胞，穿膜细胞数量显著高于blank组及IGF-Ⅱ对照组(P<0.05)，而IGF-Ⅱ对照组与blank组之间差异无统计学意义。siRNA组的Huh7细胞相对于blank组及siIGF-Ⅱ对照组，穿膜细胞数量显著降低 (P<0.05)，而siIGF-Ⅱ对照组与blank组之间差异无统计学意义，见图6、7。

Figure 5.Scratch experiment images of Huh7 cells.

图5肝癌Huh7细胞划痕实验

*P<0.05vsIGF-Ⅱ;▲P<0.05vsblank.

Figure 6.The representative result of Transwell experiment of Huh7 cells.

图6肝癌Huh7细胞Transwell实验

Figure 7.Transwell experiment results in Huh7 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsIGF-II group;#P<0.05vssiIGF-II group.

图7肝癌Huh7穿膜细胞数

讨论

HCC是世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤之一，我国属于高发地区，在肿瘤相关死亡原因中占第3位[1]，其发病率及死亡率逐年递增，其起病隐匿且早期极易发生转移，因此有效抑制肝癌细胞的侵袭转移是治疗肝癌的关键。

在肝癌的发生早期，IGF-Ⅱ在肝癌组织中已有过量表达，高于癌旁组织及远癌组织，并与分化程度呈负相关，即分化程度越低IGF-Ⅱ的表达量越高，而且在肝细胞再生结节及肝细胞不典型增生这些肝癌前病变中表达量更高，在肝炎、肝硬化到肝细胞癌的整个演变过程中，IGF-Ⅱ mRNA的异常表达也表现出逐渐递增的趋势，这些研究结果提示IGF-Ⅱ与肝癌的发生发展密切相关，尤其在肝癌的初期阶段发挥着重要作用[2-3]。

1IGF-Ⅱ表达与肝癌细胞生长、增殖的关系

IGF-Ⅱ作为一种非常强的丝裂原，可以促进多种细胞的增殖调控因子，我们采用CCK-8法和平板克隆实验观察IGF-Ⅱ表达与肝癌的生长和增殖的关系，结果显示：高表达IGF-Ⅱ对肝癌Huh7细胞的生长增殖有促进作用，下调IGF-Ⅱ表达可抑制肝癌的生长。其它抑制IGF-Ⅱ表达方法也有相似效果，如Zhang等[4]利用以IGF-Ⅱ基因P3启动子为靶点合成的脱氧核酶转染肝癌SMMC-7721细胞成功下调IGF-Ⅱ基因，MTT法绘制生长曲线发现与对照组相比生长能力被明显抑制。Yao等[5]通过构建靶向IGF-Ⅱ的miRNA转染肝癌HepG2细胞下调IGF-Ⅱ基因，发现细胞的克隆形成能力下降。目前认为其可能的机制是肝癌细胞通过分泌大量的IGF-Ⅱ，直接作用于自身或通过细胞间隙作用于周围肝细胞膜上的IGF-ⅠR和/或IGF-ⅡR，促发分子间及信号通路的级联反应，形成一个自我促进增殖的自分泌及旁分泌系统，以促进肝癌细胞的增殖[6-8]。阻断IGF-Ⅱ表达抑制肝癌细胞则有可能成为肝癌基因治疗的手段之一。

2IGF-Ⅱ表达与肝癌细胞迁移、侵袭的关系

目前已有临床观察发现IGF-Ⅱ与肝癌的转移能力密切相关，如Qian等[9]利用PCR法检测38例伴肝外转移的肝癌患者,其循环中IGF-ⅡmRNA阳性率达100%，远高于不伴肝外转移者11.1%的阳性率；Xiong等[10]利用酶联免疫法检测肝癌患者血清中IGF-Ⅱ含量，发现IGF-Ⅱ的水平与化疗后肝癌的转移情况呈正相关。相关研究表明[11-12]，在体内外实验中miR-625可通过抑制IGF-II mRNA结合蛋白1(IGF-ⅡBP1)阻止肝癌细胞的迁移和侵袭。我们在细胞水平利用划痕实验和Transwell小室实验进行检测，结果发现IGF-Ⅱ的表达对肝癌Huh7细胞的侵袭迁移有促进作用，下调IGF-Ⅱ表达能够削弱肝癌的侵袭迁移能力，其机制尚未清楚，有研究表明[13],肝癌细胞迁移、侵袭与上皮间充质转化相关，我们将行进一步研究来验证IGF-Ⅱ是否涉及其中。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Role of IGF-Ⅱ in proliferation and migration of hepatocellular carcinoma Huh7 cells

CHEN Lei1, CHEN Shan-fang2, GAO Fei2, HUANG Wei2

(1SecondDepartmentofInternalMedicine,GuangzhouCityHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,Guangzhou510800,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thuangw@163.com)

[KEY WORDS]Insulin-like growth factor Ⅱ; Hepatocellular carcinoma

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects of insulin-like growth factorⅡ (IGF-Ⅱ) at different expression levels on hepatocellular carcinoma Huh7 cell proliferation and migration, and to explore the role of IGF-Ⅱ in the development of HCC. METHODS: The Huh7 cells were transfected with the over-expression plasmid pcDNA3.1(+)- IGF-Ⅱ or RNA interference plasmid pLVX-shRNA-IGF-Ⅱ by Lipofectamine 2000. The quantitative real-time PCR and Western blotting were used to verify the expression of IGF-II. The biological behaviors of the Huh7 cells were analyzed by CCK-8 assay, plate clone formation assay, cell scratch test and Transwell chamber experiment.RESULTS: Over-expression of IGF-II promoted the growth and migration of hepatocellular carcinoma cells (P<0.05), and the cell proliferation was significantly inhibited in the Huh7 cells with low IGF-II expression (P<0.05).CONCLUSION: IGF-II is involved in the regulation of biological behavior of hepatocellular carcinoma Huh7 cellsinvitro, which may play a promoting role in the development of hepatocellular carcinoma．

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1011- 06

[收稿日期]2015- 11- 10[修回日期] 2016- 04- 15

*[基金项目]广东省科技计划(No. 2010B080701063)

通讯作者△Tel: 020-38688931; E-mail: thuangw@163.com

[中图分类号]R730.23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.008