Daxx 抑制K562细胞向巨核细胞分化*

刘胜兵，　潘魏巍，　沈忠飞，　徐　营，　郭燕君，　王志坚，　黄　倩

(嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)



Daxx 抑制K562细胞向巨核细胞分化*

刘胜兵△，潘魏巍，沈忠飞，徐营，郭燕君，王志坚，黄倩

(嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)

[摘要]目的： 观察过表达死亡结构域相关蛋白(Daxx)对K562细胞活力和向巨核细胞分化的影响。方法: 建立稳定过表达Daxx的K562细胞，荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR和Western blot检测Daxx的过表达效果，CCK-8法检测过表达后细胞活力的变化；佛波酯(PMA)诱导K562细胞向巨核细胞系分化， Western blot检测在K562细胞向巨核细胞分化过程中Daxx和p-ERK的表达变化,流式细胞术检测CD41和CD61的表达变化；PMA处理过表达Daxx的K562细胞，NBT还原实验检测细胞分化情况，流式细胞术检测过表达Daxx后CD41和CD61的表达变化，Western blot检测p-ERK的蛋白水平。结果: 建立了稳定的过表达Daxx的K562细胞，过表达Daxx抑制K562细胞的活力。PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化，CD41和CD61表达水平增高，同时p-ERK的蛋白水平升高，Daxx表达水平下降。过表达Daxx可以抑制K562细胞向巨核细胞分化，CD41和CD61表达降低，同时p-ERK的蛋白水平降低。结论: 过表达Daxx可以抑制K562细胞生长及向巨核细胞分化，同时抑制ERK的磷酸化。

[关键词]死亡结构域相关蛋白； K562细胞； 巨核细胞分化； 佛波酯

白血病是严重危害人类生命健康的血液系统恶性肿瘤，其生物学特征表现为细胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡过程发生障碍，因而导致分化异常细胞大量增殖。抑制白血病细胞增殖、促进白血病细胞分化和凋亡，是治疗白血病的基本途径。死亡结构域相关蛋白(death domain-associated protein，Daxx)是一种受体胞浆死亡结构域结合蛋白，在凋亡、转录调控、病毒感染等方面发挥重要作用。Daxx 可以通过结合DNA结合转录因子、E2A、Ets-1、 Pax3和 Pax5等参与基因表达的调控[1-2]，Pax和 Ets转录因子均和多种类型细胞的分化活动有关，Daxx可能通过影响转录因子来调控细胞分化。Daxx通过结合转录因子E2A，抑制E2A的功能，进而抑制肌细胞生成，参与肌细胞分化过程[3]。Daxx基因在白血病细胞中广泛表达，人急性白血病(acute leukemia，AL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)及其它恶性血液病细胞内均可见Daxx表达[4]。而Daxx在这些血液病中的具体作用机制，目前研究不多。Daxx在白血病细胞中的广泛表达，是否与白血病细胞的分化有关，目前未见相关报道。本实验以K562细胞为研究对象，初步研究Daxx与K562细胞向巨核细胞分化是否存在相关性。

材料和方法

1主要试剂

K562细胞株由嘉兴学院医学院提供；DMEM培养液和新生牛血清购于HyClone；Daxx购于Sigma；G418购自Amresco；兔抗CD41和CD61购自BD；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium, NBT)购自杭州昊鑫生物科技有限公司；RNA逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司；蛋白marker 购自Thermo；Lipofectamine 2000购自Invitrogen。

2主要方法

2.1细胞培养K562细胞株由本室保存，常规传代培养。采用含有10%胎牛血清的DMEM 培养基培养。

2.2稳定过表达Daxx的K562细胞系(Daxx-K562)的建立取对数生长期K562细胞接种于6孔板中，每孔用50 μL无血清 DMEM培养基稀释1 μg GFP-Daxx质粒和GFP-空载质粒(GFP-Daxx质粒和GFP-空载质粒由嘉兴学院潘巍巍博士提供);采用50 μL无血清 DMEN培养基稀释1 μL Lipofectamine 2000，混匀静置5 min；将质粒与Lipofectamine 2000混合后室温静置20 min，分别接种于培养板。置于37℃、5%CO2培养箱中48 h，荧光显微镜观察表达情况。换液，加G418后继续培养。G418筛选2周后，有限稀释法获得单个荧光表达细胞，继续培养，建立GFP-Daxx-K562细胞。

2.3实时荧光定量PCR实验TRIzol法提取各组总RNA，按试剂盒步骤逆转录后，选用10 μL体系进行荧光定量PCR，引物序列见表1。反应条件：95℃ 5 min; 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s,40个循环。

2.4CCK-8法检测细胞活力在96孔板中接种GFP-Daxx过表达组细胞和对照组细胞悬液，培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8,37 ℃孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长附近的吸光度。每组4个复孔，重复3次。

2.5流式细胞术收集佛波酯(phorbol12-myristate13．acetate，PMA)处理72 h后的GFP-Daxx过表达组和对照组细胞，连同PMA未处理组细胞， PBS 洗2遍，收集10 000个细胞，PBS稀释到50 μL重悬细胞后加入1 μL PE标记CD61抗体或CD41抗体，室温避光静置30 min，预冷PBS洗涤2次后上机检测。

2.6NBT还原实验取经PMA作用72 h后的GFP-Daxx过表达组和对照组细胞，与2 g/L的NBT溶液混合， 37℃孵育30 min后离心涂片，Giemsa染色，光学显微镜下观察胞质内含蓝灰色颗粒的阳性细胞。

2.7Western blot实验收集细胞，预冷PBS 洗涤3次后加入 RIPA 细胞裂解液，冰上放置 30 min，4℃13 000×g离心30 min，收集上清，BCA法蛋白定量。取30 μg 总蛋白进行SDS-PAGE，电转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。后加入相应I抗4℃孵育过夜，加 II 抗室温孵育2 h。最后用ECL显色试剂盒于暗室曝光显影。

3统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1过表达Daxx的K562细胞系的建立

荧光显微镜观察结果表明，GFP-Daxx在细胞内聚集，并表达于细胞核，见图1。实时荧光定量PCR检测过表达细胞系Daxx的mRNA水平显著高于对照组，Western blot结果显示，过表达Daxx的K562细胞中，Daxx蛋白表达明显升高，见图2。

2过表达Daxx对K562细胞活力的影响

CCK-8实验结果显示，过表达Daxx后K562细胞的活力明显低于对照(K562细胞)组(P<0.01)，见图3。

Figure 1. Observation under fluorescence microscope for the localization of overexpressed Daxx (green) in the K562 cells.

图1荧光显微镜结果显示K562细胞中过表达Daxx呈点状聚集

Figure 2. The results of real-time PCR (A) and Western blot (B) for determining the overexpression of Daxx in the K562 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsK562.

图2Real-time PCR结果和Western blot检测Daxx的表达情况

Figure 3. The effect of Daxx overexpression on the viability of K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsK562.

图3Daxx 过表达降低K562细胞活力

3PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化

流式细胞术分析结果显示，PMA处理K562细胞后CD41和CD61的表达升高，见图4。Western blot实验结果显示，在PMA诱导K562细胞分化的过程中，p-ERK的蛋白水平升高，Daxx的表达呈下降趋势，见图5。

4过表达Daxx对K562细胞向巨核细胞分化的影响

过表达Daxx后，PMA诱导GFD-Daxx-K562细胞向巨核细胞分化，流式细胞术检测CD41和CD61的表达均明显低于对照(K562细胞)组(P<0.01)，见图6、7。NBT还原实验结果显示，Daxx过表达后，分化细胞数量与对照组相比明显降低(P<0.05)，见图8。Western blot结果显示，过表达Daxx后，p-ERK的蛋白水平相对于对照组下降，见图9。

Figure 4.The expression of CD41 (A) and CD61 (B) after induced by PMA in the K562 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

图4PMA处理K562细胞后CD41和CD61的表达

Figure 5. The expression of p-ERK and Daxx in the PMA-induced K562 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h.

图5PMA处理K562细胞后 p-ERK和Daxx蛋白水平的变化

讨论

Daxx最初发现它是一种受体胞浆死亡结构域结合蛋白，之后证实它是一种定位于细胞核亚核结构早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein，PML)癌基因结构域(PML ocogeneic domains，PODs)的核蛋白。Daxx广泛分布于哺乳动物和人正常组织细胞及肿瘤细胞中，在凋亡、转录调控、病毒感染等方面发挥重要作用。作为一种重要的信号分子，Daxx可以在细胞质介导肿瘤坏死因子受体(tumour necrosis factor receptor，TNFR)超家族成员促凋亡信号的转导，在细胞核也可以作为转录调控因子, 在转录调控中行使转录抑制或转录激活双重功能[5-6]，通过转位、化学修饰、染色体调节、直接与转录因子或转录相关蛋白相互作用等多种方式发挥转录调控作用。Daxx广泛分布于哺乳动物和人的正常细胞及肿瘤细胞，在血液病中广泛表达，作为Fas受体胞浆死亡结构域结合蛋白，Daxx可以经Fas-Daxx-ASK1-JNK通路发挥促凋亡的作用；Daxx也可以发挥抗凋亡作用，在Daxx基因缺失的小鼠中，其胚胎干细胞发生凋亡，不能正常发育[7]。Daxx 可以结合转录相关蛋白或相关因子，如E2A、Ets-1、 Pax3和 Pax5等，进行转录激活或转录抑制的调控[1-2]。有研究表明，Daxx参与细胞分化，Daxx通过结合转录因子E2A，抑制E2A的功能，从而抑制关键的肌原性基因表达和减少肌小管的形成，抑制肌细胞生成，参与肌细胞分化过程[3]；Daxx 可以促进卵巢癌细胞的生长以及其化疗耐药性[8]，Daxx可以通过抑制自噬促进前列腺癌的发生[9]。关于Daxx在血液肿瘤中的作用，相关研究较少。

Figure 6. The expression of CD41 in PMA-induced GFP-Daxx-K562 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsK562.

图6PMA诱导Daxx过表达的K562细胞CD41的表达

Figure 7.The expression of CD61 in PMA-induced GFP-Daxx-K562 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsK562.

图7PMA诱导Daxx过表达的K562细胞CD61的表达

Figure 8.The results of nitroblue tetrazolium (NBT)-reducing test for the differentiation of the K562 cells with Daxx overexpression induced by PMA. The arrowhead pointed the differentiated cell.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsK562.

图8PMA诱导后Daxx过表达组和对照组细胞的分化情况

人白血病K562细胞株是慢性粒细胞白血病的一个典型的细胞系，其在体外被相关药物诱导后具有向巨核系、单核系或红系等多个方向分化潜能。K562细胞可以作为巨核细胞系分化模型，PMA是蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激动剂，K562细胞能被PMA诱导分化成为具有巨核系特征的细胞[10]。PKC是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，参与多种信号转导途径，在细胞生长、分化和细胞因子分泌等过程中发挥着重要作用, ERK是经典MAP信号转导分子，介导多种细胞生物学过程，包括细胞生长、存活、分化和炎症反应等。PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化过程中，ERK信号通路通常被激活[11]。目前研究表明，影响PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化的因素很多，KRAB-ZFPs是一类重要的转录调控因子，ZNF300是其典型成员，在PMA诱导K562细胞分化过程中表达上调，参与调控K562细胞巨核细胞分化[12]。电离辐射可以促进PMA诱导的K562细胞巨核细胞分化，MAPK信号通路中ERK和P38 MAPK参与此过程调控[13]。过表达7号染色体开放阅读框41 (C7ORF41)可以促进佛波酯诱导的K562细胞巨核细胞分化，p-ERK和JNK的蛋白水平升高[14]。在PMA诱导K562细胞巨核细胞分化过程中，线粒体功能发生明显改变，ROS 水平明显升高，线粒体膜电位下降，呼吸链复合体IV活性降低[15]。而关于Daxx与K562细胞巨核细胞分化的关联研究目前尚未见报道。

Figure 9.The protein levels of p-ERK in Daxx overexpressed K562 cells after induced by PMA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsK562.

图9PMA诱导Daxx-K562细胞p-ERK蛋白水平的变化

为研究Daxx在K562细胞中的作用，建立稳定表达Daxx的K562细胞系，CCK8实验结果显示，Daxx过表达后，细胞活力显著降低。通过PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化，发现在巨核细胞分化过程中p-ERK表达升高，Daxx表达下降，表明Daxx在K562细胞向巨核细胞分化过程中起抑制作用。PMA诱导Daxx-K562细胞后发现分化细胞数目降低，细胞巨核细胞分化指标CD41和CD61的表达显著降低，进一步表明Daxx参与抑制K562细胞向巨核细胞分化。Western blot结果显示，Daxx过表达后，PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化，p-ERK的蛋白水平降低，表明Daxx可能通过下调p-ERK来实现对K562细胞向巨核细胞分化的抑制，但有关深入的作用机制，还需要进一步的研究。

[参考文献]

[1]Lin DY, Lai MZ, Ann DK, et al. Promyelocytic leukemia protein (PML) functions as a glucocorticoid receptor co-activator by sequestering Daxx to the PML oncogenic domains (PODs) to enhance its transactivation potential[J]. J Biol Chem, 2003, 278(18):15958-15965.

[2]Chang CC, Lin DY, Fang HI,et al. Daxx mediates the small ubiquitin-like modifier-dependent transcriptional repression of Smad4[J]. J Biol Chem, 2005,280(11):10164-10173.

[3]Gupta A, Hou R, Liu L, et al. Daxx inhibits muscle differentiation by repressing E2A-mediated transcription[J]. J Cell Biochem, 2009,107(3):438-447.

[4]邓金牛，李春蕊，刘文励.Daxx在恶性血液病中的表达[J].华中科技大学学报:医学版,2007,36(6):729-731.

[5]Wethkamp N, Klempnauer KH. Daxx is a transcriptionalrepressor of CCAAT/enhancer-binding protein[J]. J Biol Chem,2009,284(42):28783-28794.

[6]Emelyanov AV, Kovac CR, Sepulveda MA, et al. The interaction of Pax5 (BSAP) with Daxx can result in transcriptional activation in B cells[J]. J Biol Chem,2002, 277(13):11156-11164.

[7]Michaelson JS, Leder P.RNAi reveals anti-apoptotic and transcriptionally repressive activities of DAXX[J].J Cell Sci,2003,116(Pt 2):345-352．

[8]Pan WW, Zho JJ, Liu XM,et al. Death domain-associated protein DAXX promotes ovarian cancer development and chemoresistance[J]. J Biol Chem,2013,288(19):13620-13630.

[9]Puto LA, Brognard J, Hunter T. DAXX suppresses autophagy in prostate cancer[J]. J Biol Chem, 2015, 290(25):15406-15420.

[10]Tsiftsoglou AS, Pappas IS, Vizirianakis IS.Mechanisms involved in the induced differentiation of leukemia cells[J]. Pharmacol Ther,2003,100(3):257-290．

[11]Serhan A,Huang Q,Melek E,et al. Survival role of protein kinase C (PKC) in chronic lymphocytic leukemia and determination of isoform expression pattern and genes altered by PKC inhibition[J]. Am J Hematol,2005,79(2):97-106.

[12]Cai J, Gong R, Yan F,et al. ZNF300 knockdown inhibits forced megakaryocytic differentiation by phorboland erythrocytic differentiation by arabinofuranosyl cytidine in K562 cells[J]. PLoS One, 2014,9(12):e114768.

[13]Hirose K, Monzen S, Sato H, et al. Megakaryocytic differentiation in human chronic myelogenous leukemia K562 cells induced by ionizing radiation in combination with phorbol 12-myristate 13-acetate[J]. J Radiat Res, 2013, 54(3):438-446.

[14]Sun X, Lu B, Hu B, et al.Novel function of the chromosome 7 open reading frame 41 gene to promote leukemic megakaryocyte differentiation by modulating TPA-induced signaling[J]. Blood Cancer J, 2014,4:e198.

[15]Huang R, Zhao L, Chen H, et al. Megakaryocytic diffe-rentiation of K562 cells induced by PMA reduced the acti-vity of respiratory chain complex IV[J]．PLoS One,2014,9(5):e96246.

(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Role of Daxx in inhibiting megakaryocytic differentiation of K562 cells

LIU Sheng-bing, PAN Wei-wei, SHEN Zhong-fei, XU Ying, GUO Yan-jun, WANG Zhi-jian, HUANG Qian

(SchoolofMedicine,JiaxingUniversity,Jiaxing314001,China.E-mail:ycfbing@163.com)

[KEY WORDS]Death domain-associated protein; K562 cells; Megakaryocytic differentiation; Phorbol 12-myristate 13-acetate

[ABSTRACT]AIM: To examine the effects of death domain-associated protein (Daxx) overexpression on the viability and megakaryocytic differentiation of K562 cells. METHODS: Daxx overexpression in the K562 cells was established. The expression of Daxx was detected by fluorescence microscopy, fluorescence quantitative real-time PCR and Western blot after transfection. CCK-8 assay was used to detect the cell viability after overexpression of Daxx. The expression of CD41 and CD61 in phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) induced K562 cells was detected by flow cytometry. The protein levels of Daxx and p-ERK were determined by Western blot. Nitroblue tetrazolium (NBT)-reducing test was used to assess leukemia cell differentiation in Daxx-overexpressing K562 cells and control cells. The expression of CD41 and CD61 induced by PMA in Daxx-overexpressing K562 cells was analyzed by flow cytometry. The protein levels of Daxx and p-ERK were also examined by Western blot. RESULTS: The stable overexpression of Daxx in the K562 cells was established. The viability was reduced in Daxx-overexpressing K562 cells. The expression of CD41 and CD61 was significantly increased after PMA induction in the K562 cells (P<0.01). The protein expression of Daxx was reduced, but the protein level of p-ERK was increased. The expression of CD41 and CD61 was reduced after PMA induction in Daxx-overexpressing K562 cells (P<0.01). The protein level of p-ERK was also reduced. CONCLUSION: Daxx overexpression inhibits the growth, megakaryocytic differentiation and production of p-ERK in the K562 cells.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1004- 07

[收稿日期]2015- 11- 24[修回日期] 2016- 03- 10

*[基金项目]“十二五”浙江省高校药理学重点学科资助项目;嘉兴市科技局项目(No. 2015AY23063);嘉兴学院重点SRT项目(No.851715065)

通讯作者△Tel：0573-83643850； E-mail：ycfbing@163.com

[中图分类号]R329.21; R730.23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.007