黄芪甲苷通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻重症急性胰腺炎大鼠肝损伤

张海云，　常香荣

(陕西省康复医院内科， 陕西 西安 710065)



黄芪甲苷通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻重症急性胰腺炎大鼠肝损伤

张海云，常香荣△

(陕西省康复医院内科， 陕西 西安 710065)

[摘要]目的： 探讨黄芪甲苷对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠相关急性肝损伤的影响及作用机理。方法: 将96只健康SD大鼠随机分成假手术组、模型组(SAP组)、黄芪甲苷治疗组和AG490干预组，每组24只。对大鼠采用逆行胰胆管注射5% 牛磺胆酸钠(1 mL/kg)建立SAP 模型。黄芪甲苷治疗组和AG490干预组大鼠于造模前2 h分别腹腔注射20 mg/kg黄芪甲苷和8.0 mg/kg AG490，假手术组和模型组各自注射对应量的0.9%生理盐水。处理结束后每组分别于12 h、18 h和24 h各组随机取8只大鼠检测其腹水量，下腔静脉穿刺采血检测血淀粉酶(AMY)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平，酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。HE染色观察各组大鼠肝脏组织病理变化。Western blot检测各组大鼠肝脏组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平。结果: 各时点模型组大鼠腹水量和血清中AMY、ALT、AST以及IL-6、TNF-α、IL-1β水平明显高于假手术组，黄芪甲苷和AG490干预组大鼠这些指标明显低于模型组。同时，模型组大鼠与假手术组相比，p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显上调。黄芪甲苷和AG490预处理则明显改善大鼠肝损伤，并抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平。结论: 黄芪甲苷能够通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化从而减轻重症急性胰腺炎大鼠急性肝损伤。

[关键词]黄芪甲苷； JAK2/STAT3信号通路； 重症急性胰腺炎； 肝损伤

急性胰腺炎是由于胰酶异常激活，进而对胰腺自身组织消化，继而引起胰腺水肿、坏死，并产生一系列并发症如腹腔感染、休克等全身性炎症性疾病，可分为轻症和重症两类[1]。重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)起病急、发展快、病情重，死亡率达20%，严重威胁着患者的生命[2-3]。SAP发生时，体内大量炎性介质失控释放，导致其它器官损伤，而肝损伤是SAP 常见的器官损伤之一[4]，SAP并发肝脏损伤的发生率高达40%[5]。黄芪甲苷是从黄芪中提取的中药单体，是黄芪药理作用的重要成分。现代医学研究发现黄芪具有抗氧化、抗炎、扩张血管的作用[6-7]。本实验通过建立SAP大鼠肝损伤模型，观察黄芪甲苷对SAP大鼠急性肝损伤的治疗效果，并探讨其可能的机制。

材料和方法

1实验动物

清洁级雄性SD大鼠96只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号: SCXK(京)2009-0004]，饲养8周，室温维持在23 ℃±1 ℃，体重210～280 g。

2主要试剂

黄芪甲苷(纯度98%)购于成都康邦生物科技有限公司；AG490 购自Alexis；水合氯醛购于青岛宇龙海藻有限公司，用生理盐水配制10%的水合氯醛无菌溶液，剂量按照250 mg/kg(体重)计算；牛磺胆酸钠购于Sigma，用生理盐水溶解并配成5%牛磺胆酸钠溶液，剂量按照1 mL/kg(体重)计算；大鼠肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA试剂盒均购于eBioscience；HE染色剂购于北京索莱宝科技有限公司；磷酸化的Janus激酶2(phosphorylated Janus kinase 2，p-JAK2)和磷酸化的信号转导与转录激活因子3(phosphory-lated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)单克隆抗体购于CST；兔抗大鼠β-actin抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。HF-220全自动生化分析仪购于泰诺科贸有限公司。

3主要方法

3.1动物分组处理及造模将大鼠随机分为假手术组、模型组、黄芪甲苷组和AG490干预组，每组24只。术前禁食12 h，自由饮水。依照Aho法[8]建立大鼠SAP模型：常规10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)腹部皮下注射麻醉后开腹，拉细硬膜外导管经十二指肠乳头逆行经电子微量泵注入5%牛磺胆酸钠(1 mL/kg，0.1 mL/min)制作SAP模型。造模前2 h黄芪甲苷组和AG490组大鼠分别腹腔注射20 mg/kg黄芪甲苷(根据不同浓度的预实验确定此浓度对急性胰腺炎大鼠具有治疗作用)和8.0 mg/kg AG490，假手术组和模型组大鼠腹腔注射对应剂量的0.9%生理盐水。假手术组开腹仅将胰腺组织翻动后关腹。造模过程中黄芪甲苷组和AG490组没有出现大鼠死亡现象，模型组出现2只大鼠死亡。考虑到大鼠造模的死亡，在造模时实际大鼠数量多于实验分组数量，以便于及时补充实验中死亡大鼠。大鼠清醒后自由饮水，禁食。

3.2标本采集及指标检测各组大鼠造模后分别于12 h、18 h和24 h麻醉大鼠，常规消毒、铺巾、拆线，进入腹腔观察腹腔内腹水情况。分别称量麻醉后大鼠重量，用注射器抽取各组大鼠腹腔积水，再用纱布蘸尽脏器表面残留少量积水，然后再次称量大鼠的重量，两次重量差值就是对应腹水量的重量。寻找并充分暴露下腔静脉，用促凝管分别抽取2.5 mL静脉血液。使用HF-220全自动生化分析仪测定血清淀粉酶(amylase，AMY)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。采用ELISA试剂盒测定血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

3.3HE染色取麻醉处死大鼠的肝脏1 cm×1 cm×1 cm组织块用PBS配制的10%甲醛液固定后石蜡包埋，切片后经苏木精-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察肝脏组织的病理学改变。

3.4Western blot检测各组大鼠肝脏JAK2和STAK3的磷酸化水平取200 mg 肝组织，RIPA裂解液裂解后冰浴下超声匀浆，10 000×g4 ℃离心15 min，取上清液，-70 ℃冰箱冻存。Bradford法蛋白定量，每孔加样量30 μg，7.5% SDS-PAGE分离蛋白；蛋白转移至PVDF膜，新鲜配制的含5% BSA的TBST 液室温封闭1 h，加入兔抗大鼠p-JAK2和p-STAT3单克隆抗体(1∶1 000)和兔抗大鼠β-actin 抗体(1∶1 000)，4 ℃反应过夜；将膜取出，TBST液洗5 min 3 次，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 的 II 抗孵育；ECL显影，BandScan 5.0 凝胶电泳图像分析软件行条带灰度扫描，以β-actin为内参照对p-JAK2和p-STAT3进行灰度值半定量分析。以上实验重复3次，取均值。

4统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1观察各组大鼠腹腔大体情况

假手术组大鼠腹腔基本正常，无腹水渗出。模型组大鼠肠管壁充血肿胀明显，肠管颜色变暗，肠腔内聚集大量液体和粪便，各时点均可见血性腹水且逐渐增多。黄芪甲苷和AG490干预组大鼠上述情况比模型组明显减轻，血性腹水量明显减少，差异有统计学显著性(P<0.05)。比较相同处理组大鼠在不同时点的腹水量，发现模型组、黄芪甲苷组和AG490组随着造模时间的增加腹水量也显著增加，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图1。

2比较各组大鼠血清AMY、ALT和AST的水平

同一时点内模型组中各监测指标均高于假手术组(P<0.05)，黄芪甲苷和AG490干预组中各指标水平均明显低于模型组(P<0.05)。分析相同处理组在不同时点之间的数据得知，假手术组中检测AMY、ALT和AST水平无明显变化，而其余3组各自指标检测水平均随造模时间的增加而呈现显著增加趋势，差异有统计学显著性(P<0.05)，见表1。

Figure 1.The weight of ascites in the mice of each group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vssham-operated group;*P<0.05vsmodel group;$P<0.05vs12 h;&P<0.05vs18 h.

图1各组大鼠腹水重量的比较

#P<0.05vssham-operated group;*P<0.05vsmodel group;$P<0.05vs12 h;&P<0.05vs18 h.

3比较各组大鼠血清促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度

同一时点内模型组促炎细胞因子检测浓度均明显高于假手术组(P<0.05)，黄芪甲苷和AG490干预组中各种促炎细胞因子检测水平均明显低于模型组(P<0.05)。对相同处理组在不同时点的数据分析得知，假手术组各时点之间促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度无明显变化，而其余3组各自检测水平均随造模时间的增加而呈现显著增加趋势，差异有统计学显著性(P<0.05)，见表2。

4各组大鼠肝组织的HE染色观察

HE染色结果显示，同一时点内与假手术组相比，模型组大鼠出现明显肝损伤以及一定程度的间质水肿，伴有部分毛细血管的充血和严重的炎症细胞浸润；同一时点与模型组相比，黄芪甲苷组和AG490组中肝损伤明显减轻，但仍有间质的水肿和少量炎症细胞的浸润；相同处理组在不同时点的HE染色结果显示，假手术组均无出现肝损伤，没有炎症细胞浸润现象，模型组、黄芪甲苷组和AG490组均随着造模时间的增加出现越来越明显的肝损伤，见图2。

#P<0.05vssham-operated group;*P<0.05vsmodel group;$P<0.05vs12 h;&P<0.05vs18 h.

Figure 2.Pathological changes of liver tissues in the mice of each group (HE staining, ×100).

图2各组大鼠肝组织病理学改变

5分析各组大鼠肝组织p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的变化

与假手术组相比，模型组中各个时点大鼠肝组织p-JAK2和p-STAT3蛋白水平显著增加(P<0.05)；与模型组相比，黄芪甲苷组和AG490组中各个时点p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平显著降低，差异有统计学显著性(P<0.05)。对相同处理组在不同时点数据分析发现，假手术组各时点之间p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平无明显变化，其余3组各自p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平随着造模时间的增加而呈现显著增加趋势，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in the liver tissues in the mice of each group. A: sham-operated group; B: model group; C: astragaloside Ⅳ treatment group; D: AG490 treatment group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vssham-operated group;*P<0.05vsmodel group;$P<0.05vs12 h;&P<0.05vs18 h.

图3各组大鼠肝组织中p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的比较

讨论

SAP可引起全身炎症反应综合征，严重的可导致多脏器功能衰竭，死亡率极高[9]。肝脏是SAP胰外脏器损伤的主要器官之一[10]。急性胰腺炎的患者，特别是SAP患者，由于肠道细菌易位造成的不良结果后因肝脏的特殊解剖结构和生理功能进一步加重肝脏损伤，因此SAP患者若伴发肝功能严重损伤其恢复往往很慢，并且预后不佳。在SAP的病程中，肝脏的细胞通透性增强，肝脏的解毒作用减弱，一些内源性毒素无法在肝脏内降解，就会进入血液循环，因此会引起一系列重要的炎性反应[11]。主要的临床表现为：反映肝脏功能的ALT和AST活性升高，其升高程度反映了肝脏的受损情况。肝脏解毒作用的减弱将严重影响患者疾病的治疗和恢复过程，患者的多器官衰竭也从肝脏功能衰竭开始，进而出现肾功能不全、肺功能障碍等等，因此在SAP的诊治过程中，需要特别维护患者的肝功能，这对于患者的预后具有重要的意义。早发现、早控制肝功能损害是控制病情进展、防止肝功能不全的关键措施之一，SAP引起肝损伤机制复杂，临床中尚无特效药，本实验主要研究黄芪甲苷对SAP肝损伤的影响及作用机制。

在急性胰腺炎的发病过程中，胰腺细胞释放大量炎症介质和细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β等[12]，并且研究已经证实黄芪甲苷对急性胰腺炎大鼠血清中促炎性细胞因子具有抑制作用[13]。JAK/STAT信号通路是多种细胞因子信号转导的共同通路之一，可转导多种细胞因子细胞内的信号，将细胞膜感受到的信号直接传递至核内，启动基因转录[14]。JAK2和STAT3作为该家族中的重要成员，在信号转导过程中发挥着重要作用[15]。研究表明，多种细胞因子可诱导JAK2活化，进而激活下游STAT3表达，最终导致细胞行为和功能的改变[16]。目前已发现多种细胞因子，包括TNF-α、IL-6、IL-1β等，它们通过激活JAK/STAT信号转导通路，在炎症反应的发生、发展过程中发挥作用[17]。研究已证实急性胰腺炎模型中JAK2/STAT3信号通路受到激活[4]。同时，研究也表明JAK2/STAT3信号通路激活可诱导IL-6、IL-8表达上调，加重了SAP肺损伤[18]。因此，急性胰腺炎发病过程与JAK2/STAT3信号通路密切相关。黄芪甲苷是从中药黄芪中分离得到的一种皂苷类化合物，是黄芪的主要活性成分，具有较好的抗炎、抗氧化作用[19]，目前尚未报道黄芪甲苷在急性胰腺炎中对JAK2/STAT3信号通路的影响。

本研究中发现，同一时点内与假手术组相比，急性胰腺炎模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β浓度显著增加，并且TNF-α、IL-6和IL-1β浓度随着造模时间的增加而增加。结合肝脏组织病理观察发现，随着肝脏病理损伤的加重，肝脏组织中炎症细胞浸润明显，考虑可能是由于SAP 时炎症细胞过度浸润，诱导炎症因子大量释放所致。由此可见，SAP早期炎症因子的高表达与胰腺炎肝损伤程度密切相关。本研究进一步检测显示假手术组中p-JAK2和p-STAT3均呈低水平，然而同一时点内模型组p-JAK2 和p-STAT3的蛋白水平均比假手术组明显增加，并且模型组内p-JAK2 和p-STAT3蛋白水平随着造模时间的增加而显著增加，其表达量与各炎症因子变化水平在时间上保持一致。考虑可能在SAP时，炎症因子的过度表达导致JAK2 和STAT3的活化，使其与相应位点结合，进而诱导了JAK2/STAT3通路进一步活化，促进炎症的发生以及肝脏损伤。因此，我们推断在急性胰腺炎发生的过程中，肝损伤的严重程度、血清炎性因子的浓度以及肝组织中JAK2和STAT3的磷酸化水平均随着时间的增加而显著增加。实验结果表明，急性胰腺炎模型给予黄芪甲苷或者AG490处理后，任何相同时点内与模型组相比，大鼠肝损伤都显著减轻，炎性因子浓度也显著降低，同时p-JAK2 和p-STAT3的蛋白水平也显著受到抑制。AG490是JAK2选择性抑制剂，可通过阻断JAK特异位点上的酪氨酸或丝氨酸磷酸化而阻断下游激酶STAT的活化，进而抑制细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的炎性效应。在本实验中黄芪甲苷显著降低急性胰腺炎模型大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量，具有改善急性胰腺炎肝损伤的作用，同时抑制JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，这同AG490对急性胰腺炎肝损伤的作用相一致。因此，我们推断黄芪甲苷可以通过调控JAK2/STAT3信号通路减轻急性胰腺炎大鼠肝损伤。本研究阐述了黄芪甲苷对急性胰腺炎肝损伤的作用机理，同时为临床急性胰腺炎肝损伤的治疗提供理论支持。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Astragaloside Ⅳ inhibits JAK2/STAT3 signaling pathway and alleviates severe acute pancreatitis-associated acute liver injury in rats

ZHANG Hai-yun, CHANG Xiang-rong

(DepartmentofInternalMedicine,ShaanxiProvincialHospitalofRehabilitation,Xi’an710065,China.E-mail:fangjiezhengzhou@163.com)

[KEY WORDS]Astragaloside Ⅳ; JAK2/STAT3 signaling pathway; Severe acute pancreatitis; Liver injury

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of astragaloside Ⅳ on severe acute pancreatitis (SAP)-associated acute liver injury in the rats and to explore the underlying mechanisms. METHODS: Male Sprague-Dawley (SD) rats (n=96) were randomly divided into sham-operated group, SAP model group, astragaloside Ⅳ treatment group and AG490 treatment group. SAP model was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate (1 mL/kg) into the biliopancreatic duct. The rats in astragaloside Ⅳ treatment group were intraperitoneally injected with 20 mg/kg astragaloside Ⅳ, while the rats in AG490 treatment group were injected with 8.0 mg/kg AG490 2 h before sodium taurocholate injection. The rats in sham-operated group and model group received the same volume of saline. The rats were sacrificed at 12 h, 18 h and 24 h after the treatment. The levels of ascites, serum amylase, ALT and AST were detected after the blood samples were collected by the puncture through inferior vena cava. The serum levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β were also examined by ELISA. Furthermore, HE staining was used to observe the liver pathological changes, and the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in the liver were evaluated by Western blot. RESULTS: Compared with sham-operated group, the levels of ascites, serum amylase, ALT, AST, IL-6, TNF-α and IL-1β in the rats in model group were significantly increased, while they were decreased in the rats in astragaloside Ⅳ treatment group and AG490 treatment group compared with the rats in model group. Meanwhile, the phosphorylation levels of JAK2 and STAT3 was significantly increased in model group compared with sham-operated group. The rats in astragaloside Ⅳ treatment group and AG490 treatment group both had a better improvement in the liver injury and lower phosphorylation levels of JAK2 and STAT3.CONCLUSION: Astragaloside Ⅳ exerts a protective effect on pancreatitis-associated acute liver injury in the rats possibly via inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathway.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 0984- 06

[收稿日期]2015- 12- 23[修回日期] 2016- 03- 31

通讯作者△Tel： 029-88222973; E-mail: fangjiezhengzhou@163.com

[中图分类号]R576； R285.5

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.004