PTEN在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义*

吴云婷，　刘　岩，　刘　梦，　杨梦如，　莫碧瑶，　潘云峰

(中山大学附属第三医院风湿免疫科，广东 广州 510630)



PTEN在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义*

吴云婷，刘岩，刘梦，杨梦如，莫碧瑶，潘云峰△

(中山大学附属第三医院风湿免疫科，广东 广州 510630)

[摘要]目的： 探讨第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)在人类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)中的表达水平及意义。方法: 利用组织块法获得并体外培养人RA-FLS、骨关节炎(OA)-FLS及关节创伤-FLS；采用实时荧光定量PCR法检测各组FLS中PTEN mRNA表达水平的差异；采用Western blotting法检测各组FLS的PTEN蛋白表达水平以及Akt Thr308位点磷酸化水平的差异。结果: (1) RA-FLS中的PTEN mRNA表达水平显著低于OA-FLS及关节创伤-FLS(P<0.01)，而OA-FLS与关节创伤-FLS之间的PTEN mRNA表达水平无统计学差异。(2) RA-FLS的PTEN 蛋白表达水平显著低于OA-FLS及关节创伤-FLS(P<0.05)，而OA-FLS与关节创伤-FLS之间的PTEN蛋白表达水平无统计学差异。(3) RA-FLS中的Akt蛋白Thr308位点磷酸化水平显著高于OA-FLS及关节创伤-FLS(P<0.01)，且OA-FLS中该位点的磷酸化水平显著低于关节创伤-FLS(P<0.01)。(4)RA-FLS中的PTEN蛋白水平与Akt Thr308位点磷酸化水平呈显著负相关(P<0.01)。结论: RA-FLS中PTEN基因呈低水平表达，可能与Akt Thr308位点磷酸化水平异常增高相关。

[关键词]PTEN； Akt； 关节炎， 类风湿； 成纤维样滑膜细胞

类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis, RA)是一种病因未明的慢性全身性炎症性疾病。RA主要累及关节滑膜，滑膜炎症细胞浸润以及衬里层增生是其典型病理表现。RA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是滑膜衬里层中特殊的细胞群，它发生了类肿瘤样改变，与RA滑膜的持续性的慢性炎症、关节破坏和滑膜增生都有密切的关系[1]。而目前有关其生物学特性及变化机制尚未清楚。

第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)为一抑癌基因。PTEN蛋白具有双特异磷酸酯酶活性，广泛地参与调节细胞周期、抑制细胞增殖、抑制细胞迁移、维持染色体稳定性等生命活动。PTEN对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路的负性调控作用在多种细胞得到证实[2]。有研究发现，RA患者滑膜衬里层的PTEN mRNA低表达；相关动物实验亦提示RA-FLS中PTEN mRNA低表达[3]。本文将比较RA-FLS与其它关节疾病FLS之间的PTEN表达和Akt Thr308位点磷酸化水平的差异，研究PTEN在RA-FLS中的异常表达状态及其对PI3K/Akt通路的影响。

材料和方法

1标本采集

关节滑膜组织取自中山大学附属第三医院2014年3月至2015年9月期间行膝关节置换术或膝关节关节镜手术的患者。RA患者4名，平均年龄48岁(33～58岁)，3名为女性；骨关节炎(osteoarthritis, OA)患者5名，平均年龄72.3岁(64～79岁)，均为女性；创伤患者4名，平均年龄29.7岁(18～45岁)，均为男性。所有RA患者均符合1987年美国风湿病学会类风湿关节炎分类标准；所有OA患者均符合1995年美国风湿病学会膝骨关节炎分类标准；所有创伤患者均排除了RA、OA及其它系统性结缔组织病诊断。

2主要试剂

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及高糖DMEM无血清培养基购自Gibco；RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和SYBR® Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)均购自TaKaRa；蛋白提取用Lysis Buffer购自南京凯基生物科技有限公司；cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets和PhosStop Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets购自Roche；PTEN Rabbit mAb、Phospho-Akt(Thr308) Rabbit mAb和Akt (pan) Rabbit mAb均购自CST；兔抗GAPDH多克隆IgG抗体购自杭州贤至生物科技有限公司；HRP标记羊抗兔IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

3主要方法

3.1FLS的培养与鉴定滑膜组织经10% PBS缓冲液清洗后，用眼科剪反复剪切成1 mm×1 mm×1 mm的小块。将组织块移入培养瓶铺置均匀，加入适量含10%FBS的DMEM培养液，于5% CO2、37 ℃培养箱内直立4h后放倒培养。视细胞生长情况及培养液性状每3～4d换液1次。当细胞生长到覆盖瓶底约80%即可进行传代培养，经多次传代后可获得纯度较高的FLS。通过2种方法进行培养细胞的鉴定：于光学相差显微镜下观察细胞形态以及通过流式细胞术检测培养细胞的CD55阳性率。本实验使用的是第3～5代FLS。

3.2实时荧光定量PCR法检测PTEN mRNA的表达收集细胞，用RNAiso Plus裂解细胞，经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀、洗涤，最后溶于适量的RNase-free水中。用分光光度计进行RNA的纯度分析，A260/A280在1.8～2.0的范围内表示RNA纯度较好。按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒说明书进行反转录，条件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。依照SYBR® Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR反应。引物序列见表1。反应体系体积20 μL，使用ABI 7500实时定量PCR仪，反应程序为：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,循环40次;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应结束后分析各孔Ct值，并计算各样本的2-ΔΔCt值。

3.3Western blotting法检测PTEN蛋白表达以及Akt Thr308位点磷酸化水平提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，用Western blotting法检测各组FLS的PTEN蛋白表达及Akt(Thr308)磷酸化水平。配制不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分离胶浓度为10%，各样品取20 μg总蛋白进行凝胶电泳。经凝胶电泳分离蛋白质后，通过电转印法将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上。用5% BSA封闭PVDF膜上的非特异性蛋白结合位点，再用相应的Ⅰ抗稀释液(稀释比1∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜。使用HRP标记的Ⅱ抗稀释液(稀释比1∶2 000)室温孵育1～2 h后，浸泡ECL发光液并进行曝光。通过Image-Pro Plus软件分析曝光图像，读取各条带的积分吸光度(integral absorbance，IA)值，计算各样本的目的蛋白与内参照GAPDH的IA比值进行目的蛋白的相对定量。

4统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni法，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

结果

1FLS的鉴定

光学显微镜下观察可见细胞呈细长纺锤形；胞核居中，卵圆形，边界清楚，核仁明显，与成纤维细胞相似，鉴定细胞形态与FLS相符，见图1。流式细胞术检测第3代细胞的CD55表达阳性率达92.8%，提示实验用细胞的FLS纯度较高，见图2。

Figure 1.Morphology of the third generation of RA-FLS observed under optical microscope (×100).

图1光镜下第3代RA-FLS形态

Figure 2.CD55 expression in the third generation of RA-FLS detected by flow cytometry.

图2流式细胞术检测第3代RA-FLS表面CD55阳性率

2FLS的PTEN mRNA表达差异

用实时荧光定量PCR法检测各组细胞内PTEN mRNA的表达，Ct值经GAPDH标准化后，以关节创伤-FLS为对照计算2-ΔΔCt值进行分析。RA-FLS的PTEN mRNA表达水平显著低于OA-FLS及关节创伤-FLS(P<0.01)，而OA-FLS与关节创伤-FLS之间的PTEN mRNA表达水平无统计学差异，见图3。

3FLS的PTEN蛋白表达差异

用Western blotting法检测各组细胞的PTEN蛋白表达水平，IA值经GAPDH标准化后分析得，RA-FLS的PTEN 蛋白表达水平显著低于OA-FLS及关节创伤-FLS(P<0.05)，而OA-FLS与关节创伤-FLS之间的PTEN蛋白表达水平无统计学差异，见图4。

Figure 3.PTEN mRNA expression in FLS. Compared with other groups, the expression of PTEN mRNA was significantly decreased in RA-FLS. Mean±SD.n=3～4.**P<0.01vsRA-FLS.

图3各组FLS的PTEN mRNA表达水平

Figure 4.PTEN protein expression in FLS. Compared with other groups, the expression of PTEN was significantly decreased in RA-FLS. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsRA-FLS.

图4各组FLS的PTEN 蛋白表达水平

4FLS的Akt(Thr308)磷酸化程度差异

用Western blotting法检测各组细胞的p-Akt(Thr308)蛋白及Akt总蛋白表达水平，Akt总蛋白IA值经GAPDH标准化，以p-Akt(Thr308)蛋白与Akt总蛋白的IA比值表示Akt蛋白Thr308位点的磷酸化水平。分析得，RA-FLS、OA-FLS及关节创伤-FLS之间的Akt总蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)；RA-FLS的Akt蛋白Thr308位点的磷酸化水平显著高于OA-FLS及关节创伤-FLS(P<0.01)，且OA-FLS该位点的磷酸化水平显著低于关节创伤-FLS(P<0.01)，见图5。

5RA-FLS中的PTEN蛋白水平与Akt(Thr308)磷酸化水平的联系

对RA-FLS中的PTEN蛋白水平与Akt(Thr308)磷酸化水平进行关联性分析，我们发现两者之间呈显著负相关，Pearson积矩相关系数为-0.994 5(P<0.01)，见图6。

讨论

RA的基本病理改变为滑膜炎。RA-FLS在RA的发病机制中起关键作用，具有一定的类肿瘤性，表现在以下几个方面：(1)增殖能力增强，凋亡减少。在体外培养细胞及人源化RA动物模型的研究中发现，RA-FLS 在体外或脱离体内免疫系统环境的情况下仍具有增殖的特性[1]。(2)迁移侵袭能力增强。

Figure 5.Phosphorylation level of Akt(Thr308) in FLS. Compared with other groups, the phosphorylation level of Akt(Thr308) was significantly increased in RA-FLS, while the phosphorylation level of Akt(Thr308) in OA-FLS was the lowest. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsRA-FLS;##P<0.01vstrauma-FLS.

图5各组FLS的Akt(Thr308)磷酸化水平

Figure 6.Pearson correlation between the phosphorylation level of Akt(Thr308) and PTEN protein expression in RA-FLS, showing a significant negative correlation.

图6RA-FLS中Akt Thr308位点磷酸化水平与PTEN蛋白水平的关联性分析

在没有外来刺激的情况下，人源化RA动物模型中的RA-FLS能够通过外周血液循环迁移至远处的关节软骨，并对软骨发生侵袭作用，且这种迁移和侵袭作用不能被TNF-α拮抗剂所抑制，提示RA-FLS可在关节腔内迁移、侵袭同时，还可跨内皮的长距离迁移和侵袭[4]。(3)分泌功能紊乱。RA-FLS通过分泌蛋白酶、细胞因子、小分子炎症介质等成分，产生促侵蚀、趋化炎性细胞、促炎等作用[1]。

在本研究中设有2个对照组，分别为OA-FLS以及关节创伤-FLS。OA是一种常见于老年人的关节退行性疾病，其主要特征为关节软骨的侵蚀、边缘骨增生，软骨下硬化等改变，在滑膜组织中，也存在低水平的滑膜炎症。与RA相比，OA滑膜炎较弱且较局限[5]。另一对照的理想来源为健康人的滑膜组织，但因取材困难，最终选择半月板损伤等轻型关节创伤患者的滑膜组织培养得FLS。

PTEN是人类10号染色体上的一个抑癌基因[6]，其编码的PTEN蛋白主要分布于胞质中，蛋白氨基端(N端)是其主要结构功能区，含有使PTEN蛋白具有肿瘤抑制活性的磷酸酶残基序列及与细胞张力蛋白(tensin)、辅组蛋白(auxilin)同源的序列，是PTEN蛋白发挥蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性所必需的。PTEN可通过去磷酸化方式参与细胞调控，且主要通过脂质磷酸酶活性完成，这在已知的抑癌基因中十分少见。目前已知PTEN抑制细胞生长、促进细胞凋亡的作用主要通过3条途径完成：(1)通过对3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)去磷酸化抑制PI3K/Akt通路；(2)通过对灶性黏连激酶(focal adhesion kinase, FAK)去磷酸化下调p130Crk联系底物(p130Crk-associated substrate, p130Cas)，抑制细胞浸润、转移，同时FAK去磷酸化还可抑制PI3K活性从而抑制PI3K/Akt通路；(3)选择性抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)。其中研究得最多的是其对PI3K/Akt通路的抑制作用[7]。在正常组织和细胞当中，PTEN基因及蛋白表达水平较高，半衰期较长。然而在某些疾病尤其在肿瘤中，PTEN基因会出现不同程度的缺失和突变，PTEN蛋白也相应出现下调和异常[8]。有报道称，对RA患者滑膜组织的免疫组化实验未检测到衬里层(FLS聚集区)的PTENmRNA表达，而衬里下层的表达水平较高；通过将RA患者的滑膜细胞及人类软骨移植入SCID小鼠构建人源化动物模型发现，侵蚀软骨的RA滑膜细胞几乎检测不到PTEN mRNA的表达,提示PTEN的低表达与RA FLS的侵袭能力有一定的联系[3]。

Akt为丝/苏氨酸蛋白激酶，其中央激酶结构域中的308位点含Akt部分活化所必需的苏氨酸，羧基末端的调节区中的473位点包含Akt完全活化所必需的丝氨酸[9]。目前认为Akt蛋白激酶的完全激活需要其自身这2个磷酸化位点的磷酸化。经磷酸化激活后的Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游一系列靶蛋白，经多种途径促进细胞存活，是重要的抗凋亡调节因子[10]。本课题组的前期研究发现，MK-2206(可抑制Akt的Thr308位点和Ser473位点的自身磷酸化作用)抑制Akt磷酸化可明显抑制RA-FLS细胞活性，且该抑制作用呈时间和剂量依赖性，提示Akt的磷酸化参与了RA-FLS增殖及活化。另有多项研究发现Akt的异常激活还参与了RA的软骨破坏、免疫异常等活动，在RA的致病机制中发挥了重要作用。

与肿瘤细胞类似，RA-FLS内存在多条信号通路的异常，课题组前期研究就发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTOCR2)/Akt通路在RA-FLS中存在异常活化[11]。而Akt上游的另一通路， PI3K/Akt通路，是细胞内重要信号转导通路之一，广泛存在于细胞中，参与细胞增殖、凋亡及分化等功能的调控作用，在多种肿瘤细胞中激活。PI3K被激活后，可催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-biphosphate, PIP2)生成PIP3，PIP3将Akt和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK-1)募集到细胞膜，在PDK1的辅助下，使Akt Thr308位点磷酸化，同时，在mTORC2、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2(phosphoinositide-dependent kinase 2, PDK-2)或整合素连接的激酶(integrin- linked kinase，ILK)等作用下，Ser473位点也发生磷酸化后，Akt成为有活性的激酶[12-13]。PTEN蛋白具有脂质磷酸酶活性，可使其底物PIP3去磷酸化而失活，与PI3K作用相反，从而抑制Akt Thr308位点的磷酸化，抑制了PI3K活化信号向Akt传导，对PI3K/Akt信号通路起着负调控作用[2]。可见Akt和PTEN分别是PI3K/Akt信号通路中的效应因子和负性调节因子。

本课题使用的是体外培养的FLS细胞，细胞纯度较高，细胞类型更有针对性；另外，相关实验结果也可在一定程度上反映某些分子水平的异常是否会因为细胞脱离体内炎症环境以及细胞传代而发生改变。通过Western blotting及荧光定量PCR，我们发现无论是在mRNA水平还是蛋白水平，RA-FLS中的PTEN均呈低表达，与相关研究结果一致。结合滑膜组织的PTEN mRNA免疫组化结果及相关动物实验结果，说明RA-FLS中PTEN的低表达是持续存在的。为了探索PTEN在RA-FLS中是否影响PI3K/Akt通路，在前期发现RA-FLS存在Akt Ser473位点磷酸化水平增高的基础上，我们通过Western blotting研究Akt(Thr308)位点的磷酸化水平，发现RA-FLS中Akt(Thr308)位点的磷酸化水平同样存在异常增高，且Akt(Thr308)位点的磷酸化水平与PTEN蛋白水平呈负相关，提示RA-FLS中PI3K/Akt通路激活可能与PTEN低表达相关。有趣的是，OA-FLS与关节创伤-FLS的PTEN表达水平无显著差别，但OA-FLS的Akt(Thr308)磷酸化水平显著低于关节创伤-FLS。可能的原因有：PI3K/Akt通路有多种调控分子，在OA-FLS中，可能还有其它分子参与了Akt(Thr308)磷酸化过程的调节；而创伤关节内亦存在一定炎症反应，可能会促进Akt的活化；另外，关节创伤组患者年龄明显低于OA组患者，发生创伤后组织的自我修复能力较强，在细胞增殖等修复过程中可能存在PI3K/Akt通路的激活。

PTEN的调控细胞周期、抑制细胞凋亡、抑制细胞迁移侵袭等功能已被普遍认识，尤其是在肿瘤领域。本研究证明了RA-FLS中的PTEN呈低表达，且可能造成下游Akt(Thr308)磷酸化水平上升。考虑到PTEN及p-Akt的作用，我们有理由推测PTEN的低表达可致RA-FLS类肿瘤化，而增加PTEN表达可逆转该过程。这一设想已在动物模型中得到验证：将表达人PTEN基因的腺病毒载体注入CIA大鼠的关节腔内，可引起大鼠RA FLS中的Akt磷酸化水平下降，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)产生减少，且FLS凋亡增加[14]。由此，增加局部PTEN表达可为干预RA进展提供新思路。

总之，本研究证明PTEN在RA-FLS中呈持续性低水平表达，在细胞脱离体内炎症环境以及细胞传代后依然存在，而这可能与Akt Thr308位点磷酸化水平异常增高相关。至于PTEN在RA-FLS持续低表达的原因，仍值得进一步研究。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Expression and function of PTEN in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis

WU Yun-ting, LIU Yan, LIU Meng, YANG Meng-ru, MO Bi-yao, PAN Yun-feng

(DepartmentofRheumatology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:panyunfeng@medmail.com.cn)

[KEY WORDS]PTEN; Akt; Arthritis, rheumatoid; Fibroblast-like synoviocytes

[ABSTRACT]AIM: investigate the expression ofPTENgene in fibroblast-like synoviocytes (FLS) of rheumatoid arthritis (RA).METHODS: FLS were isolated from synovial tissue obtained from the patients with RA, osteoarthritis (OA) or joint trauma. The mRNA expression of PTEN was detected by RT-qPCR. The protein levels of PTEN, p-Akt (Thr308) and total Akt were determined by Western blotting. The phosphorylation status of Akt was analyzed by the protein ratio of p-Akt (Thr308)/total Akt.RESULTS: The mRNA expression of PTEN was significantly lower in RA-FLS than that in OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.01), while no statistically significant difference was observed between that in OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.05). Similarly, the protein expression of PTEN in the RA-FLS was much lower than that in the OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.05), and there was no difference between the latter 2 groups. Moreover, the phosphorylation level of Akt (Thr308) in the RA-FLS was significantly higher than that in the other 2 control groups (P<0.01), and that in OA-FLS was much lower than that in the joint trauma-FLS (P<0.01). Finally, Pearson correlation analysis between the phosphorylation level of Akt (Thr308) and PTEN protein expression in the RA-FLSs showed a significant negative correlation (r=-0.994 5,P<0.01).CONCLUSION: The mRNA and protein expression of PTEN are both decreased in the RA-FLS, which may contribute to the increased phosphorylation level of Akt (Thr308).

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 0978- 06

[收稿日期]2015- 12- 21[修回日期] 2016- 04- 05

*[基金项目]广东省自然科学基金资助项目(No. 2014A030313080)

通讯作者△Tel: 020-82179589; E-mail： panyunfeng@medmail.com.cn

[中图分类号]R593.22; R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.003