马钱子碱通过抑制IL-6/STAT3信号通路诱导结肠癌SW480细胞凋亡*

李　逦，　王　纯，　卢宏达

(武汉市中心医院肿瘤科，湖北 武汉 430014)



马钱子碱通过抑制IL-6/STAT3信号通路诱导结肠癌SW480细胞凋亡*

李逦，王纯，卢宏达△

(武汉市中心医院肿瘤科，湖北 武汉 430014)

[摘要]目的： 探讨马钱子碱(brucine)在体外对人结肠癌SW480细胞生长和凋亡的影响及可能的分子机制。方法: 实验以人结肠癌细胞系SW480细胞为研究对象，分为空白对照组、 brucine(1 μmol/L)处理组、IL-6(100 μg/L)处理组和brucine(1 μmol/L)与IL-6(100 μg/L)联用组，用CCK-8法检测细胞活力抑制率；流式细胞术Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡；Western blot法检测凋亡相关蛋白表达。细胞免疫荧光检测相关蛋白表达定位和强度。结果: Brucine处理组和brucine与IL-6联用组都能抑制结肠癌细胞的活力，brucine浓度相同时，联用组抑制率小于brucine处理组(P<0.05)。与空白对照组相比，单用brucine处理组凋亡细胞明显增多(P<0.05)。与单用brucine相比，brucine与IL-6联用组凋亡细胞明显减少(P<0.05)。与对照组相比， brucine能降低p-STAT3蛋白水平。与空白对照组相比，单用brucine组p-STAT3的蛋白减少，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax和执行凋亡的cleaved PARP明显增多；与空白对照组相比，单用IL-6处理组的p-STAT3明显增多(P<0.05)；而与单用brucine相比，brucine与IL-6联合应用组的p-STAT3蛋白增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增多，促凋亡蛋白Bax和执行凋亡的cleaved PARP均相对减少(P<0.05)。结论: 体外细胞实验中brucine可能通过调节IL-6/STAT3通路，抑制结肠癌SW480细胞中STAT3的磷酸化激活，从而发挥抗肿瘤作用。

[关键词]马钱子碱； 结肠癌； IL-6/STAT3通路； 细胞凋亡

结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤。我国结直肠癌的发病率呈逐年递增趋势[1]。目前化学治疗仍然是结直肠癌治疗的关键方法之一。近年来，随着新的化疗药物、靶向药物的出现及化疗方案的制定，结直肠癌治疗取得了巨大进步，但仍有较大部分患者疗效欠佳，甚至出现治疗后复发或转移。因此，寻找新的治疗方法和药物，以减少肿瘤复发，改善患者生存质量，显得尤为重要。马钱子，另名番木鳖，为马钱属植物马钱(Strychnosnux-vomicaL．)的成熟种子,其主要有效成分为生物碱类，包括马钱子碱(brucine)、士的宁(strychnine)、番木鳖次碱(vomicine)等。药理学研究表明，马钱子生物碱有多重药理作用，主要包括镇痛抗炎、抗菌、抗血栓、抑制中枢神经系统等[2]。近年来关于马钱子碱的抗肿瘤活性作用引起关注[3]。马钱子碱是白色结晶性粉末，分子式为C23H26N2O4，分子量为394.45。马钱子碱对肝癌、非小细胞肺癌、乳腺癌骨转移和大肠癌都有明显的抑制作用，但其具体作用机制有待深入研究[4]。本实验用马钱子碱作用于人结肠癌细胞SW480，探讨马钱子碱对SW480细胞活力和凋亡的影响，探讨其抗人结肠癌的作用靶点，为马钱子碱用于临床治疗结肠癌提供实验基础。

材料和方法

1材料和仪器

人结肠癌细胞SW480购自ATCC，细胞复苏后置于RPMI-1640培养基中，37 ℃、5% CO2、95%湿度培养箱中培养；马钱子碱购自成都曼斯特生物科技有限公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒购自Dojindo；Annexin V/PI双染试剂盒购自北京宝赛生物技术公司； IL-6购自Peprotech；荧光 II 抗购自Cell Signaling Technology；DAPI购自Roche；cleaved PARP、Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3和GAPDH抗体均购自Cell Signaling Technology；化学发光试剂ECL购自Pierce；倒置显微镜(Olympus)；荧光显微镜(Zeiss)；流式细胞仪(BD FACScantoTM)。

2方法

2.1CCK-8法检测brucine对人结肠癌SW480细胞活力的影响实验设空白对照组、brucine(1 μmol/L)处理组、IL-6(100 μg/L)处理组和brucine(1 μmol/L)联用IL-6(100 μg/L)组。取对数生长期的SW480细胞，以每孔100 μL含5 000个细胞的悬液接种于96孔板。将其置于37 ℃、5% CO2、95%湿度培养箱中培养24 h后去上清，按分组加入马钱子碱和(或)细胞因子IL-6处理，每组5个复孔。各组用RPMI-1640培养基培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h，酶标仪检测吸光度(A)值(测定波长450 nm)，计算各组细胞活力抑制率。细胞活力抑制率(%)= (A对照组-A实验组)/A对照组×100%。同时倒置显微镜观察单用马钱子碱和马钱子碱联用细胞因子IL-6组光镜下细胞形态变化。

2.2Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡实验设空白对照组、brucine(1 μmol/L)处理组、IL-6(100 μg/L)处理组和brucine(1 μmol/L)联用IL-6(100 μg/L)组。 取对数生长期SW480细胞接种于6孔培养板过夜，弃上清，按分组加入1 μmol/L的马钱子碱和(或)100 μg/L的细胞因子IL-6。培养24 h后，PBS洗涤细胞3次，按试剂盒说明书分别加入Annexin V-FITC 和PI，4 ℃避光反应30 min，再加入300 μL binding buffer，均匀吹打后，流式细胞术检测细胞凋亡。

2.3Western blot实验将处理后的细胞，用PBS冲洗，蛋白裂解液冰上充分裂解后，置于4 ℃ 12 000 r/min 离心30 min，取上清液，测定蛋白含量，加入上样缓冲液沸水中煮5 min，进行SDS-PAGE。300 mA恒流转膜；膜用5%脱脂牛奶封闭2 h，然后加 I 抗在4 ℃孵育过夜。次日PBS洗3遍，每次5 min，再加II抗在摇床室温孵育1 h，洗膜后经ECL发光试剂显影，最后于暗室X线胶片感光。

2.4细胞免疫荧光染色取对数生长期细胞，以1×108/L浓度接种于放有消毒灭菌玻片的6孔板中，设置空白对照组、brucine(1 μmol/L)处理组和brucine(4 μmol/L)处理组。培养24 h后，弃培养基，用PBS洗2次，每次5 min，用4%多聚甲醛1 mL室温固定30 min。用PBS洗2次，每次5 min，加入0.1%～0.2% Triton溶液1 mL，室温反应20 min。用PBS洗2次后加入5% BSA封闭1 h。加入相应的 I 抗，4 ℃过夜。弃 I 抗后避光，加入1∶1 000的荧光 II 抗，室温孵育1 h。加入DAPI溶液，室温避光反应15 min，用PBS洗2次后在载玻片上滴上甘油(甘油∶PBS=1∶1)，将盖玻片的细胞面，贴于载玻片上，四周用指甲油封片。

3统计学处理

实验结果数据以均数±标准差(mean±SD)表示，SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理，运用方差分析进行组间差异比较，各组数据方差齐时，组间多样本均数两两比较采用SNK-q检验分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结果

1单独应用brucine和brucine联用IL-6对结肠癌细胞生长的影响

CCK-8法检测发现，1 μmol/L的 brucine抑制结肠癌细胞的细胞活力(P<0.05)。Brucine和IL-6联合应用时也能抑制结肠癌细胞的细胞活力，但brucine浓度相同时，brucine和IL-6联用组的细胞活力更好，抑制率小于单用brucine组(P<0.05)。 Olympus 倒置显微镜也观察到类似结果，单用brucine(1 μmol/L)时，光镜下变圆、折光率变低的细胞较多，brucine(1 μmol/L)和IL-6(100 μg/L)联用给药组光镜下变圆、折光率变低的细胞相对较少，见图1。

Figure 1.The viability inhibitory rate of the SW480 cells treated with brucine and brucine combined with IL-6. The cell morphology was observed under microscope (×400). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsbrucine.

图1单用brucine和brucine联用IL-6对结肠癌细胞活力的抑制率

2单独应用brucine和brucine联用IL-6对结肠癌细胞凋亡的影响

Annexin V/PI双染流式细胞仪检测结果显示，与空白对照组相比，单用brucine(1 μmol/L)组凋亡细胞明显增多(P<0.05)，而单用IL-6(100 μg/L)时无明显细胞凋亡。与单用brucine(1 μmol/L)相比，brucine(1 μmol/L)和IL-6 (100 μg/L)联用组凋亡细胞明显减少(P<0.05)，见图2。

3Brucine降低SW480细胞中p-STAT3蛋白水平

Western blot检测结果显示，与对照组相比，1 μmol/L和4 μmol/L的brucine均能抑制p-STAT3的蛋白水平，浓度越高，抑制效率越明显(P<0.05)，而总STAT3蛋白表达变化不明显。细胞免疫荧光检测结果显示，对照组中p-STAT3蛋白主要定位在细胞核，为绿色荧光，4 μmol/L的brucine处理组中绿色荧光的p-STAT3蛋白明显减少，见图3。

4Brucine促进SW480细胞凋亡与降低p-STAT3蛋白水平密切相关，IL-6介导的p-STAT3升高可以降低brucine对SW480细胞凋亡的作用

如图4所示，Western blot结果显示，与空白对照组相比，单用brucine(1 μmol/L)组p-STAT3和抗凋亡蛋白Bcl-2减少，促凋亡蛋白Bax和执行凋亡的活化的cleaved PARP明显增多；与空白对照组相比，单用IL-6(100 μg/L)处理组的p-STAT3蛋白明显增多(P<0.05)；而与单用brucine(1 μmol/L)组相比，brucine(1 μmol/L)和IL-6(100 μg/L)联用组抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Bax和执行凋亡的活化的cleaved PARP均相对减少(P<0.05)。

Figure 2.The apoptosis of SW480 cells induced by brucine and brucine combined with IL-6. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsbrucine.

图2单用brucine和brucine联用IL-6对结肠癌细胞凋亡的影响

Figure 3.The effects of brucine induction for 24 h on the protein levels of p-STAT3 and STAT3 were detected by Western blot (A) and immunofluorescence staining (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vs1 μmol/L brucine.

图3Brucine抑制SW480细胞的p-STAT3蛋白水平

讨论

近年来发现，brucine对多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用[5]。在肝癌细胞HepG2的体外研究中，brucine主要通过调节钙离子浓度以及线粒体的去极化抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，也有研究表明brucine能通过条件缺氧诱导因子的相关通路抑制肝癌细胞的侵袭和转移[6-7]。在非小细胞肺癌体外细胞实验中，brucine可以通过抑制NF-κB表达和随后的COX-2基因表达介导肺癌A549细胞的细胞凋亡[8]。在乳腺癌骨转移的裸鼠体内模型中，brucine可能通过下调VEGF表达抑制肿瘤血管生成，抑制乳腺癌的生长及骨转移[9]。在多发性骨髓瘤体外细胞实验中，brucine增强U266细胞中JNK信号通路c-Jun和磷酸化水平诱导的细胞凋亡[10]。在结肠癌LoVo细胞中，brucine通过下调KDR激酶活性抑制结肠癌细胞增殖，抑制其血管生成，同时brucine能通过上调Bax和下调Bcl-2表达介导LoVo细胞凋亡和细胞周期阻滞[11-12]。同样的，在人单核细胞白血病细胞系THP-1中，brucine能抑制肿瘤细胞生长，将细胞阻滞在G0/G1期并诱导细胞凋亡[13]。根据以上研究结果提示，brucine主要通过抑制肿瘤血管生成，介导细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。

近年研究表明，STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点，STAT3靶点的活化在肿瘤发生发展中作用尤为重要[14]。STAT3在多种肿瘤细胞和组织中都存在过度激活，如乳腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、脑瘤、非小细胞肺癌和各种白血病等[15]。STAT3激活后调控相关关键基因的表达，促进细胞增殖(MYC和cyclin D1/D2)、抗细胞凋亡(Bcl-xL、Mcl1、survivin和P53)、促进血管生成(VEGF、HIF1和P53)、迁移和侵袭(MMP3和MMP9)，从而表现出致癌作用[16]。

Figure 4.The protein levels of the apoptosis-related molecules in the SW480 cells induced by brucine and brucine combined with IL-6invitrodetected by Western blot after 24 h treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsbrucine.

图4Brucine诱导的SW480细胞凋亡与下调p-STAT3密切相关，IL-6介导的p-STAT3的升高可以降低brucine诱导的SW480细胞凋亡

在本研究中我们发现，在人结肠癌SW480细胞中，brucine可能通过下调肿瘤细胞中STAT3磷酸化水平，来抑制SW480细胞活力，同时上调细胞内促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2，使剪切的DNA修复酶PARP增多，介导细胞凋亡。Brucine与IL-6联用时，可能由于IL-6能激活并维持肿瘤细胞中STAT3磷酸化水平，导致brucine抑制SW480细胞凋亡的能力减弱。综上所述，我们在体外细胞实验中证明了brucine可能通过调节IL-6/STAT3通路，抑制结肠癌SW480细胞中STAT3磷酸化激活，而发挥抗肿瘤作用。同时，我们需要进一步使用IL-6抑制剂证明brucine通过调节IL-6/STAT3通路发挥抗结肠癌作用，以及在动物体内验证brucine通过抑制STAT3磷酸化激活进而对抗结肠癌的作用机制，为临床上运用brucine治疗结肠癌提供参考。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Brucine induces apoptosis in colon cancer SW480 cells via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway

LI Li, WANG Chun, LU Hong-da

(DepartmentofOncology,TheCentralHospitalofWuhan,Wuhan430014,China.E-mail:phlonda@163.com)

[KEY WORDS]Brucine; Colon cancer; IL-6/STAT3 pathway; Cell apoptosis

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects of brucine on the viability and apoptosis of colon cancer SW480 cells.METHODS: The SW480 cells were divided into control group, 1 μmol/L brucine treatment group, 100 μg/L IL-6 treatment group and IL-6+brucine treatment group. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The apoptotic rate was measured by flow cytometry using fluorescein-labeled Annexin V/PI. The changes of apoptosis-related proteins were determined by Western blot. The protein level of p-STAT3 was also detected by immunofluorescence staining. RESULTS: Brucine inhibited SW480 cell growth, and the viability inhibition rate of the SW480 cells treated with brucine alone was more efficient than using brucine combined with IL-6 (P<0.05). The apoptotic SW480 cells increased significantly after 1 μmol/L brucine treatment as compared with brucine treatment alone (P<0.05). The apoptotic SW480 cells were significantly reduced in brucine and IL-6 combination treatment group (P<0.05). Brucine inhibited the protein level of p-STAT3 significantly. The protein level of p-STAT3 was significantly increased in 100 μg/L IL-6 treatment group. Compared with 1 μmol/L brucine treatment alone, the expression of Bcl-2 was increased and the protein levels of p-STAT3, Bax and cleaved PARP were reduced in brucine and IL-6 combination treatment group (P<0.05).CONCLUSION: Brucine may inhibit the activation of STAT3 phosphorylation in IL-6/STAT3 pathway to exert an antitumor effect on SW480 cellsinvitro.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 0998- 06

[收稿日期]2015- 12- 07[修回日期] 2016- 03- 01

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81372931);湖北省自然科学基金资助项目(No. 2012FFB05904);武汉市科技攻关计划(No. 2013060602010253)

通讯作者△Tel: 027-65699909; E-mail: phlonda@163.com

[中图分类号]R730.23; R735.3+7

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.006