达努塞替对HL-60细胞抗肿瘤作用机制的研究*

何思佳，　舒莉萍，　任　涛，　何志旭△

(1贵州医科大学附属医院儿科，贵州 贵阳 550001；2第三军医大学大坪医院肿瘤科，重庆 400042)



达努塞替对HL-60细胞抗肿瘤作用机制的研究*

何思佳1，舒莉萍1，任涛2，何志旭1△

(1贵州医科大学附属医院儿科，贵州 贵阳 550001；2第三军医大学大坪医院肿瘤科，重庆 400042)

[摘要]目的： 探讨丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂达努塞替对人急性髓细胞白血病(AML)细胞株HL-60的细胞周期阻滞、自噬和凋亡的影响。方法: 用MTT法检测达努塞替对HL-60细胞的生长抑制作用；用流式细胞术检测相同时间不同浓度药物组与同一浓度不同时间组的细胞周期、细胞凋亡及细胞自噬；用Western blot方法检测细胞周期相关蛋白CDK1/CDC2、 CDK2、 cyclin B1、 P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53，凋亡相关蛋白Bcl-xL、Bcl-2、 Bax、 PUMA、cleaved caspase-3及cleaved caspase-9以及自噬相关蛋白p-PI3K、PTEN、p-Akt、 p-mTOR、Beclin 1、LC3-I和LC3-II的水平。用共聚焦显微镜检测同时间不同浓度药物组细胞的自噬情况。结果: 达努塞替能明显抑制HL-60细胞的活力，诱导细胞周期G2/M期阻滞，可以通过线粒体caspase-3途径诱导细胞凋亡，同时可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导细胞自噬。结论: 达努塞替可通过抑制作为染色体伴侣蛋白且在有丝分裂中调控染色质复制与分离的极光激酶A/B有效抑制HL-60细胞生长，引起细胞周期阻滞、凋亡和自噬发生，可能是AML临床治疗具有前景的抗肿瘤靶点。

[关键词]PI3K/Akt/mTOR信号通路； 细胞周期； 细胞凋亡； 自噬； HL-60细胞

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)的一种亚型，以骨髓及外周血中异常增多的早幼粒细胞为主要特征，占AML的15%，预后凶险[1-2]。出血并发症是导致APL早期死亡主要原因。因此，研究AML新的治疗靶点和开发新药十分必要。

极光激酶(Aurora kinase)家族是一类结构与功能高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞有丝分裂中起重要调控作用[3-5]。其活性异常及过表达可以导致非整倍体的出现及细胞癌变。Sen等[4]首先发现早期乳腺癌中极光激酶A的高表达，并相继在胰腺癌和胃癌细胞中发现极光激酶A的过表达。而且，极光激酶A和B的过表达可促进AML的病情进展，增加AML细胞的增殖能力和侵袭性[6]。因此，抑制极光激酶成为肿瘤治疗的新策略。

已有一些靶向极光激酶的抑制剂，且显示出抑制肿瘤生长的作用，有望进入临床[7]。丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂达努塞替(danusertib，Danu；化学结构见图1A)是一种有效的泛极光激酶抑制剂，对极光激酶家族成员均有抑制作用，但主要抑制极光激酶B，极具发展前景[8-9]。目前，国内尚未见有关于使用达努塞替作用于AML细胞的基础研究。

材料和方法

1细胞株与试剂

人HL-60细胞株由美国南佛罗里达大学周树锋教授惠赠。达努替塞、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Sigma；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)购自Thermo；细胞凋亡试剂盒购自BD ；自噬检测试剂盒购自Enzo Life Sciences；p-Aurora kinase B、Aurora kinase B、p-mTOR、m-TOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗体均购自于CST；β-actin及II 抗购自于Santa Cruz。

2方法

2.1细胞培养及实验分组HL-60细胞使用含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)、链霉素(100 mg/L)和2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM(Corning)培养液，细胞在5% CO2、37 ℃恒温培养箱内培养。实验分为空白对照组、阴性对照组(0.05%的DMSO)和Danu实验组。Danusertib实验组用0.1、1和5 μmol/L的Danu处理HL-60细胞24 h，或用5 μmol/L Danu处理HL-60细胞4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h后观察相关指标变化。

2.2MTT法检测细胞活力取对数生长期的HL-60细胞加入96孔板， 每孔8 000个。设空白对照组、阴性对照组(0.05%的DMSO)和Danu实验组，每组设6个复孔。培养24 h后，每孔加入 MTT试剂，混匀后继续培养3 h，离心去上清，再加入100 μL DMSO，酶标仪490 nm处读吸光值。通过在Danu浓度曲线下细胞的相对活力值计算半数抑制浓度(IC50)。

2.3流式细胞术检测细胞周期收集各组HL-60细胞，PBS洗2次，分别以3 mL 70%的乙醇固定于-20 °C过夜，用含有1 g/L RNase A 和50 mg/L PI的PBS重悬细胞。室温下避光孵育30 min 后使用流式细胞仪(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)检测G1、S与G2/M期的细胞分布情况。

2.4流式细胞术检测细胞凋亡收集各组HL-60细胞预冷PBS洗2次，用含有2.5 μL的Annexin V-PE和2.5 μL的7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D,7-AAD；核酸染料)的1×binding buffer 100 μL轻柔重悬细胞，室温避光孵育15 min后，加入150 μL 1×binding buffer，在1 h内使用流式细胞仪检测细胞死亡率、早期凋亡率及晚期凋亡率。

2.5流式细胞术检测细胞自噬收集各组HL-60细胞，分别用250 μL 1×assay 缓冲液洗涤 1 次，再用250 μL含有0.25 μL Cyto-ID和0.25 μL Hoechst的1×assay缓冲液轻柔重悬细胞，置于37 °C避光孵育30 min，离心弃上清，分别加入250 μL 1×assay缓冲液轻柔混后移入流式管，置于冰上于1 h内于流式细胞仪检测细胞自噬率。

2.6Western blot检测细胞周期相关蛋白及PI3K/mTOR信号通路相关蛋白的表达取处于对数生长期的HL-60细胞，按预定浓度和时间Danu处理细胞后，预冷PBS洗涤2次，加入细胞裂解液110 μL冰上裂解，14 000g/min、4 ℃离心15 min，平衡后，100 ℃下变性5 min。35 μg蛋白上样，聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后，转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，孵I抗4 ℃过夜，II抗室温孵育2 h，使用化学发光剂Bio-Rad ChemiDocTMXRS 显影，条带用Image Lab 3.0 (Bio-Rad)软件分析。

2.7激光共聚焦显微镜观察HL-60细胞自噬分别收集0.1、1和5 μmol/L浓度的Danu处理24 h后的HL-60细胞，1×assay 缓冲液洗涤1次，使用100 μL含有0.25 μL Cyto-ID与0.25 μL Hoechst的1×assay缓冲液轻柔混匀细胞，37 ℃避光孵育30 min，1×assay缓冲液洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定20 min后， 1×assay缓冲液洗3次。取5 μL细胞滴入载玻片，用盖玻片推片，滴入20 μL含有DAPI的Mouting media(Sigma)并指甲油封片，使用TCS SP2 laser scanning 共聚焦显微镜(Leica)，以405/488 nm波长检测HL-60细胞自噬信号。

3统计学处理

采用Prism 5.0统计学软件进行结果处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较则采用单因素方差分析(one-way ANOVA)结合Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1达努塞替对HL-60细胞活力的抑制

MTT方法检测结果显示，以0.1、1、10、25、50和100 μmol/L Danu处理HL-60细胞24 h，细胞生长抑制率分别为97.2%、99.3%、71.5%、61.9%、32.9%和30.1%，与对照组相比，Danu能明显抑制HL-60细胞生长(P<0.05)，IC50值为30.19 μmol/L,见图1B。

Figure 1. The chemical structure (A) and the effect of danusertib (Danu) on the viability of HL-60 cells for 24 h determined by MTT assay (B). Mean±SD.n=3.

图1达努塞替的化学结构及其对HL-60细胞活力的影响

2达努塞替对HL-60细胞中极光激酶B的抑制

如图2所示，与对照组比较，0.1～5 μmol/L Danu处理HL-60细胞24 h后细胞中磷酸化极光激酶B的表达量均有所降低，其中1和5 μmol/L处理组的降低效应最显著；达努塞替明显抑制磷酸化极光激酶B活性，而总极光激酶B表达量无明显变化(P<0.05)。

Figure 2. Danusertib (Danu) inhibited the expression of phosphorylated Aurora kinase B in the HL-60 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图2达努塞替抑制HL-60细胞磷酸化极光激酶B的表达

3达努塞替诱导HL-60细胞周期G2/M阻滞

用1和5 μmol/L的达努塞替处理24 h后的HL-60细胞G2/M期百分率与对照组细胞相比均显著增加 (P<0.01)。使用5 μmol/L的达努塞替在不同时点处理HL-60细胞后，与对照组细胞相比G2/M期增加明显，48 h和72 h差异有统计学意义(P<0.01)，见图3A。

Western blot检测细胞周期相关蛋白的结果显示，促进细胞有丝分裂的蛋白质CDK1/CDC2、 CDK2和cyclin B1的表达量显著降低，相反，抑制细胞有丝分裂的蛋白质P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53的表达量显著增加。24 h的实验组中cyclin B1的表达量被显著抑制，CDK1/CDC2的表达量仅在5 μmol/L浓度组低于对照组；相反，P27Kip1和 P53的蛋白表达量与对照组细胞相比明显增加,见图3B。

4达努塞替通过激活线粒体途径诱导HL-60细胞发生凋亡

5 μmol/L Danu处理细胞24 h后，细胞凋亡率较对照组明显增加，差异有统计学显著性(P<0.01)。观察药物的时间依赖性可见，使用5 μmol/L的达努塞替处理细胞4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h的凋亡百分率分别为8.6%、9.8%、9.8%、10.3%、9.4%和13.4%;其中，在药物处理24 h和72 h后，细胞凋亡相对于对照组明显增加(P<0.01),见图4A。

0.1～5 μmol/L Danu处理细胞24 h后,促细胞凋亡蛋白Bax表达量较对照组高，而抑制细胞凋亡的蛋白Bcl-2和Bcl-xL减少。Bcl-2家族下游相关蛋白cleaved caspase-9与cleaved caspase-3均增加。随着药物浓度的增加，PUMA蛋白的表达量较对照组逐渐增加，见图4B。5 μmol/L Danu处理不同时间后，与对照组相比，Bax的表达量在处理12 h、24 h、48 h和72 h后分别增加了1.9、2.0、2.1和2.5倍；相反，Bcl-2从处理4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h 后表达量却降低到46.7%、45.7%、27.7%、43.7%、33.7%和18.0%，Bcl-xL的表达量与对照组细胞相比降低至87.3%、51.0%、30.3%、35.0%、41.3%和32.7%，见图4C。

Figure 3. Danusertib (Danu) induced cell cycle arrest in the HL-60 cells. The cells were treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h, and subjected to flow cytometric analysis. The protein samples were subjected to Western blot. A: the bar graphs showing the percentages of HL-60 cells in G1, S and G2/M phases; B: the expression of CDK1/CDC2, CDK2, cyclin B1, P21Waf1/Cip1, P27Kip1, and P53 in HL-60 cells. β-actin was used as the internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

图3达努塞替诱导细胞周期阻滞

5达努塞替通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导HL-60细胞自噬

与对照组细胞相比，0.1～5 μmol/L Danu处理细胞 24 h后，细胞自噬率增加，其中1和5 μmol/L处理组显著增加。5 μmol/L Danu处理细胞48 h和72 h自噬率与对照组相比明显增加，见图5A。Western blot的实验结果显示0.1～5 μmol/L Danu处理细胞24 h Beclin 1和LC3-II均呈显著上升趋势，见图5B。激光共聚焦显微镜观察结果亦显示自噬作用随剂量增加而增强,见图6。时间效应的研究结果亦一致,见图5C。

此外，1.5 μmol/L浓度Danu处理组p-PI3K/PI3K比率分别降低至78%和53%。同样，与对照组相比，p-Akt与总Akt的比值亦降低，然而PTEN的表达量却显著增加。除此之外，细胞在药物处理后p-mTOR/mTOR比值降低明显。综合上述结果表明达努塞替通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导HL-60细胞产生自噬，见图5B。

讨论

在细胞有丝分裂中极光激酶对中心粒周期、纺锤体变化、染色体分离及胞质分裂具有重要调控作用，并且参与细胞癌变的发生与发展。极光激酶B还是正常胞质分裂必不可少的激酶之一，它通过不同的底物分子调控胞质分裂的各个阶段。所以，极光激酶理所当然成为抗癌治疗靶点[10]。

丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂达努塞替是泛极光激酶抑制剂，作为潜在抗癌药物已经进入临床II期实验，具有抗慢性粒细胞白血病及难治性转移性前列腺癌的活性。在正常细胞中，其激酶表达仅在胸腺组织中较高，其余组织中表达水平很低，因此可以认为，此极光激酶抑制剂相对特异性的靶向肿瘤组织，对其它正常组织损伤性较小[11]。而在含有致癌基因Ras-V12的细胞中，极光激酶B过表达与促进细胞癌变与侵袭有关。同时在肝癌细胞与胰腺癌细胞中达努塞替可通过干扰细胞有丝分裂与产生多倍体来抑制细胞增殖[12]。鉴于临床资料显示ATRA治疗APL存在白细胞增多症、维甲酸综合征和维甲酸耐药三大弊端，本研究尝试使用丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂达努塞替作用于HL-60细胞，观察对其生物学特性的影响，并探讨可能涉及的分子机制，以其作为新的小分子靶向制剂的临床研究打下基础。

Figure 4.Danusertib (Danu) induced apoptotic death in the HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner. A: bar graphs showed the percentages of apoptotic cells in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h, and 72 h; B: the expression of Bcl-xL, Bcl-2, Bax, PUMA, cleaved caspase 9 and cleaved caspase 3 in the HL-60 cells treated with Danu for 24 h; C: the relative levels of Bcl-xL, Bcl-2 and Bax in HL-60 cells treated with 5 μmol/L Danu for 0～72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

图4达努塞替诱导HL-60细胞凋亡且具有剂量与时间依赖性

研究结果表明，达努塞替可以显著抑制HL-60细胞的增殖，其机制是通过抑制对有丝分裂起促进作用的CDK1/CDC2、 CDK2和cyclin B1蛋白表达，增加细胞周期阻滞因子P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53蛋白的表达，引起细胞周期G2/M阻滞。综合表明，达努塞替可引起细胞周期重新分布，主要阻滞于G2/M期，并呈浓度及时间依赖性。达努塞替的抗肿瘤效应除了降低细胞增殖作用外，还有促进细胞凋亡的功能。既往研究发现达努塞替可以明显促进卵巢癌细胞和乳腺癌等肿瘤细胞的凋亡发生[11-12]。本研究也观察到，0.1～5 μmol/L的达努塞替处理24 h后，HL-60细胞的凋亡率上升到10.0%～13.8%，伴有药物剂量和作用时间的依赖性。由于Bcl-2家族蛋白在凋亡程序中扮有重要作用，能够通过不同的分子机制对线粒体介导的细胞凋亡发挥重要调控作用，各种凋亡刺激信号通过BH3蛋白引起Bax蛋白位移到线粒体外膜并多聚化，形成通道以刺激线粒体释放细胞色素C和Smac，细胞色素C再与凋亡蛋白酶caspase-9形成凋亡小体，导致下游通路中的级联反应的发生与发展。同时，抗凋亡蛋白Bcl-2可以通过翻译后修饰或促进PUMA，一种作为通过P53依赖途径诱导细胞凋亡的蛋白的表达量产生抑制作用[13]。因此我们通过Western blot检测了凋亡前体蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达变化。本研究亦证明在达努塞替作用下，随着剂量与时间的增加Bcl-2和Bcl-xL表达降低，而Bax和PUMA蛋白表达增加，从而启动caspase 3级联反应诱导细胞凋亡发生。

Figure 5.Danusertib (Danu) induced autophagic cell death in the HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner. A: the percentages of autophagic cells in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h; B: the protein levels of p-PI3K, PI3K, PTEN, p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin 1, LC3-I, and LC3-II in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1, and 5 μmol/L for 24 h; C: the expression of Beclin 1, LC3-I, and LC3-II in the HL-60 cells treated with Danu at 5 μmol/L for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h. β-actin was used as the internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

图5达努塞替诱导HL-60细胞自噬且具有剂量与时间依赖性

细胞自噬是细胞程序性死亡的重要部分。自噬在细胞凋亡中扮有重要作用。一般认为在肿瘤细胞中，在应激、放射或化疗等情况下，自噬起到保护细胞作用。Beclin 1 是酵母 Atg6/Vps30同源基因的表达产物， 最早被发现时它被认为是一种与细胞凋亡相关调节因子Bcl-2 相互作用的蛋白，而在肿瘤发生的过程中，则处于上调细胞自噬信号通路上最重要的调节因子。Beclin 1通常以复合物Beclin 1/PI3K3C的形式发挥作用，通过与各种蛋白的相互作用来达到调节细胞自噬的目的。LC3是唯一的 1 个定位于自噬泡内膜、参与多种信号传导调节的自噬蛋白。LC3-I为LC3前体ProLC3加工后形成的可溶体，经暴露剪切后与自噬泡膜表面PE结合，得到定位于自噬泡膜上的膜结合形式的LC3-II，LC3-II则是自噬研究中的主要标志物[14]。本研究结果显示，达努塞替能诱导HL-60细胞发生自噬。不同浓度达努塞替处理细胞24 h后细胞自噬率最高可达到20.3%，激光共聚焦显微镜观察还发现自噬作用随剂量增加而增强。本研究还发现，作为细胞自噬作用中的关键蛋白Beclin 1和LC3-II表达量显著增加，同时作为PI3K的拮抗蛋白PTEN的表达量也是显著增加，说明达努塞替对HL-60细胞自噬的促进作用具有剂量依赖及时间依赖性。而在关于涉及自噬的信号通路中，mTOR是一种PI3K相关激酶，通过mTOR信号复合物mTORC1和mTORC2形成PI3K-Akt-mTOR信号通路，是细胞内3大主要信号通路之一，PI3K/Akt/mTOR轴具有极其重要的地位和作用[15]。在一些肿瘤细胞如白血病、卵巢癌等肿瘤中经常出现该信号通路的异常活化，并参与肿瘤细胞周期、凋亡与自噬的生物学过程，调节肿瘤细胞的增殖与存活[16]。目前，该通路中的受体及激酶已经成为抗白血病的新靶点。PI3K是脂质激酶家族成员，能特异性使磷酸肌醇环上的3-羟基磷酸化，也是PI3K/Akt/mTOR通路中的始动因子。Akt又称蛋白激酶B，是信号转导通路中重要蛋白激酶，也是PI3K下游靶蛋白。mTOR是一种与PI3K/Akt通路相关的蛋白激酶，可以通过磷酸化激活与mRNA翻译相关的蛋白来增强转录与翻译，同时也能通过磷酸化灭活翻译抑制蛋白[17]。Akt通过磷酸化mTOR的Ser2448位点激活mTOR，加快肿瘤的发生[18-20]。同时，PTEN作为PI3K的拮抗蛋白也是一个重要的抑癌蛋白，研究发现，PTEN的缺失会导致肿瘤血管的生成增加而加速肿瘤的发展和转移。关于达努塞替是否通过干预PI3K/Akt/mTOR信号通路而诱导HL-60细胞自噬的机制在本实验中也得到印证。Western blot结果提示达努塞替对总PI3K、mTOR与Akt表达量没有影响，其发挥自噬作用是通过抑制磷酸化PI3K、mTOR和Akt的表达来来起作用的。据文献报道[19]，在细胞信号通路中AMPK的磷酸化位点在Thr172时对细胞自噬具有促进作用，在一些特定的环境中，AMPK在Ser317和Ser77位点的磷酸化后可直接通过Unc-51样激酶促进自噬的发生，并且p38 MAPK的激活可以抑制自噬的发生，p38 MAPK信号通路在自噬的产生中可能起一定的调控作用，我们假设以上调节通路也可能影响PI3K-Akt-mTOR通路中产生交叉作用，但调节机制尚不十分清楚。值得注意的是，达努塞替在诱导自噬的同时促进凋亡的发生。抑制自噬是否可以进一步增敏达努塞替对HL-60细胞的杀伤作用，包括体内实验研究，是未来的一个研究方向。

Figure 6. Danusertib (Danu) induced autophagy in the HL-60 cells observed under confocal microscope (×400). The HL-60 cells were incubated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h and then subjected to confocal microscopy. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图6通过共聚焦显微镜检测达努塞替诱导HL-60细胞自噬

综上所述，达努塞替对HL-60细胞可以抑制细胞增殖，激活细胞线粒体凋亡通路与诱导细胞自噬来发挥抗癌作用，这种极光激酶抑制剂可能成为今后抗AML选择性靶向治疗的新策略。

致谢：本课题在美国南佛罗里达大学药学院周树锋教授实验室完成，周树锋教授及周志伟博士等对本实验设计、实验过程及数据分析等方面给予了很大支持和指导，在此一并致谢。

[参考文献]

[1]Breccia M, Lo Coco F. Thrombo-hemorrhagic deaths in acute promyelocytic leukemia[J]. Thromb Res, 2014, 133 (Suppl 2):S112-S116.

[2]Li J, Zhou H, Hu J, et al. Progress in the treatment of acute promyelocytic leukemia: optimization and obstruction[J]. Int J Hematol, 2014, 100(1):38-50.

[3]李强，吴燕华，闫晓梅，等. 极光(aurora)激酶在细胞有丝分裂和肿瘤形成中的重要功能[J]. 生命科学, 2005, 17(5):424-432.

[4]Andrews PD, Knatko E, Moore WJ, et al. Mitotic mechanics: the auroras come into view[J]. Curr Opin Cell Biol, 2003, 15(6):672-683.

[5]Sen S, Zhou H, White RA. A putative serine/threonine kinase encoding geneBTAKon chromosome 20q13 is amplified and overexpressed in human breast cancer cell lines[J]. Oncogene, 1997, 14(18):2195-2200.

[6]Bolanos-Garcia VM. Aurora kinases[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37(8): 1572-1577.

[7]Goldenson B, Crispino JD. The aurora kinases in cell cycle and leukemia[J]. Oncogene, 2015, 34(5):537-545.

[8]Lens SM,Voest EE, Medema RH. Shared and separate functions of polo-like kinases and aurora kinases in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10(12): 825-841.

[9]Carpinelli P, Ceruti R, Giorgini ML, et al. PHA-739358, a potent inhibitor of Aurora kinases with a selective target inhibition profile relevant to cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2007, 6(12):3158-3168.

[10]陈聪琴，范艳华，吕文文，等. 抗肿瘤新靶点-极光激酶及其小分子抑制剂研究进展[J]. 国际药学杂志, 2013, 40(1):73-78, 104.

[11]Li JP, Yang YX, Liu QL, et al. The pan-inhibitor of Aurora kinases danusertib induces apoptosis and autophagy and suppresses epithelial-to-mesenchymal transition in human breast cancer cells [J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9: 1027-1062.

[12]Zi D, Zhou ZW,Yang YJ, et al. Danusertib induces apoptosis, cell cycle arrest, and autophagy but inhibits epithelial to mesenchymal transition involving PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in human ovarian cancer cells[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(11): 27228-27251.

[13]黄栋栋，孟易禹，孙栋勋，等. 牛蒡子苷元诱导人鼻咽癌CNE-1细胞凋亡及其作用机制[J]. 中国病理生理杂志，2016, 32(1):101-105.

[14]Meulenbeld HJ, Mathijssen RH, Verweij J, et al. Danusertib, an aurora kinase inhibitor[J]. Expert Opin Invest Drugs, 2012, 21(3):383-393.

[15]Benten D, Keller G, Quaas A, et al. Aurora kinase inhi-bitor PHA-739358 suppresses growth of hepatocellular carcinomainvitroand in a xenograft mouse model[J]. Neoplasia, 2009, 11(9):934-944.

[16]Ghobrial IM, Witzig TE, Adjei AA. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(3):178-194.

[17]Dunlop EA, Tee AR. mTOR and autophagy: a dynamic relationship governed by nutrients and energy[J]. Semin Cell Dev Biol, 2014, 36:121-129.

[18]Jiang X, Overholtzer M, Thompson CB. Autophagy in cellular metabolism and cancer[J]. J Clin Invest, 2015, 125(1):47-54.

[19]Kim J, Guan KL. Regulation of the autophagy initiating kinase ULK1 by nutrients: roles of mTORC1 and AMPK[J]. Cell Cycle, 2010, 10(9):1337-1338.

[20]Guertin DA, Sabatini DM. Defining the role of mTOR in cancer[J]. Cancer Cell, 2007, 12(1):9-22.

(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Antitumor mechanism of danusertib in human AML HL-60 cells

HE Si-jia1, SHU Li-ping1, REN Tao2, HE Zhi-xu1

(1DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guizhou550001,China;2CancerCenter,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:hzx@gmc.edu.cn)

[KEY WORDS]PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Cell cycle; Apoptosis; Autophagy; HL-60 cells

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of danusertib, a pan-inhibitor of Aurora kinases, on the viability, cell cycle, apoptosis and autophagy of human acute myelocytic leukemia (AML) HL-60 cells.METHODS: The effect of danusertib on the viability of HL-60 cells was examined by MTT assay. The effect of danusertib on apoptosis of HL-60 cells was quantitated by the flow cytometry using an Annexin V/7-AAD apoptosis detection kit. The effect of danusertib on autophagy in the HL-60 cells was assessed by flow cytometry and confocal microscopic analysis. The levels of various proteins related to the cell cycle, apoptosis and autophagy were determined by Western blot.RESULTS: Danusertib decreased the viability of human AML HL-60 cells and induced the cell cycle arrest in G2/M phase. Danusertib also induced mitochon-drium-dependent apoptosis by activation of caspase-3 and autophagy in the HL-60 cells via inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.CONCLUSION: Danusertib shows effective antitumor ability for promising AML treatment.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 0990- 08

[收稿日期]2015- 12- 07[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 31460312)

通讯作者△Tel: 0851-86908118； E-mail: hzx@gmc.edu.cn

[中图分类号]R730.23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.005