原发性肝癌患者CTCs与CD4+/CD8+、NLR、TTV及肿瘤分期的相关性研究*

万　磊，　陈佳佳，　刘建军，　阚和平

(南方医科大学南方医院肝胆外科， 广东 广州 510515)



原发性肝癌患者CTCs与CD4+/CD8+、NLR、TTV及肿瘤分期的相关性研究*

万磊，陈佳佳，刘建军，阚和平△

(南方医科大学南方医院肝胆外科， 广东 广州 510515)

[摘要]目的： 探讨原发性肝癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs)与T细胞亚群CD4+/CD8+比值、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、肿瘤总体积(TTV)及肿瘤分期的关系。方法：收集80例原发性肝癌患者外周血，采用益善生物技术公司使用的“免疫去除结合纳米过滤法” CanPatrolTM行CTCs 检测。同时使用流式细胞术检测外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量；收集患者外周血中性粒细胞数、淋巴细胞数、肿瘤最大直径及肿瘤分期等临床病理参数。计算出外周血CD4+/CD8+比值、NLR及TTV。根据CD4+/CD8+平均值及TTV、NLR中位数将CD4+/CD8+比值、TTV和NLR分为高、低2组；根据肝癌第7版TMN分期标准将患者分为I+II 期和 III+IV期2组。分别比较CTCs在2组中的差别。结果：高CD4+/CD8+比值组外周血CTCs数及间质型CTCs数明显低于低CD4+/CD8+比值组(P<0.05)。高TTV组外周血的CTCs数、间质型CTCs数及混合型CTCs数明显高于低TTV组(P<0.05)；肿瘤分期 I、 II 期组外周血的CTCs数、间质型CTCs数及混合型CTCs数明显低于 III、IV期组(P<0.05)。高NLR组与低NLR组外周血的CTCs数、间质型CTCs数、混合型CTCs数和上皮型CTCs数间的差异无统计学显著性。结论：原发性肝癌患者外周血中存在CTCs；外周血CTCs与T细胞免疫、TTV及肿瘤分期有显著相关：T细胞免疫越差、TTV越大及肿瘤分期越晚，外周血的CTCs越多。

[关键词]肝细胞癌； 循环肿瘤细胞； T细胞免疫； 肿瘤总体积； 中性粒细胞与淋巴细胞比值； 肿瘤分期

原发性肝癌患者术后大多数死于肿瘤复发及转移[1]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指因自发或诊疗操作由原发灶和转移灶脱落进入外周血的肿瘤细胞[2]， 其存在于多种实体瘤中。正常情况下，肿瘤越大，越容易脱落形成CTCs；肿瘤细胞进入外周血后被机体的免疫系统识别并予以清除，但当机体免疫功能低下时，将导致一部分CTCs得以存活，因而成为肿瘤复发和转移的重要原因。目前已有研究证实原发性肝癌患者外周血CTCs与复发及转移有着密切关联[3]。但肝癌CTCs与肿瘤总体积、肿瘤分期及机体细胞免疫状况的关系目前无明确的相关报道。本研究通过检测原发性肝癌患者外周血CTCs、T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+、肿瘤总体积(total tumor volume，TTV)和中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)，探讨肝癌CTCs与T细胞亚群、NLR、TTV及肿瘤分期的关系，为肝癌的疗效评估和术后治疗方式的选择提供依据。

材料和方法

1材料

收集2013年8月～2015年8月南方医院肝胆外科经手术治疗的原发性肝癌患者80例，其中男56例，女24 例，年龄28～75 岁，中位年龄46 岁。术后病理均证实为原发性肝癌。收集患者的外周血中性粒细胞数、淋巴细胞数、肿瘤最大直径、肿瘤分期等临床病理资料。其中入选的患者均排除感染、血液系统疾病等疾病，术前无化疗及免疫治疗。对入选的患者均于1周内抽取静脉血进行血常规检查，同时用EDTA抗凝采血管及普通肝素抗凝管抽取10 mL静脉血进行CTCs及T细胞亚群检测，血液标本均于抽血当日处理。

2方法

2.1CTCs的检测本研究采用广州益善公司开发的CanPatrolTM法检测外周血中CTCs。首先裂解外周血中的红细胞，通过纳米技术利用CTCs与白细胞大小差异进行CTCs的分离与富集，然后通过多重mRNA原位分析方法对富集的CTCs进行特异性基因核酸定位确定肿瘤细胞，最后通过多重RNA探针，分别针对多种CTCs特异性基因，通过不同颜色的荧光信号，将外周血中的CTCs进行分型[4]。

2.2T淋巴细胞亚群CD4+T细胞和CD8+T细胞的检测患者外周静脉血2 mL加入乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管中，充分混匀后待测。外周血T淋巴细胞亚群采用贝克曼-库尔特FC-500流式细胞仪及CD45-异硫氰酸荧光素(FITC)/CD4-藻红蛋白(RD1)/CD8-藻红蛋白德州红(ECD)荧光抗体检测。CD4+、CD8+T细胞数及CD4+/CD8+比值采用流式细胞仪和CXP软件进行荧光信号参数获取和分析。

2.3计算TTV、NLR和CD4+/CD8+比值根据影像学数据评估肿瘤负荷，肿瘤体积(cm3)=4/3×3.14×r3(r=可测量肿瘤结节的最大半径)。肿瘤总体积等于各可测量病灶体积总和。NLR为外周血中性粒细胞数/淋巴细胞数；CD4+/CD8+比值为外周血CD4+T细胞数/CD8+T细胞数。

2.4分组本研究根据TTV中位数38.86 cm3、NLR中位数2.65及CD4+/CD8+比值平均值0.921为临界值分组；根据肝癌第七版TMN分期标准将患者分为 I+II 期组和 III+IV期组2组，其中I+II 期组38例，III+IV期组42例。

3统计学处理

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。结果以均数±标准差(mean±SD)表示，两组之间比较采用独立样本t检验；相关性分析采用Spearman方法分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1外周血CTCs检测结果

CanPatrolTM法检测CTCs，发现肝癌外周血中存在上皮型、间质型和混合型3种不同类型的CTCs。其中上皮型为CD45探针阴性，EpCAM和CK8、9及19探针阳性，荧光镜下为红色荧光信号；间质型为CD45探针阴性，vimentin探针及Twist探针阳性，荧光镜下为绿色荧光信号；而混合型则在荧光镜下显示红色及绿光信号。在入组患者中CTCs的检出率为87.5%(70/80)，其中上皮型CTCs检出率为77.5%(62/80)，间质型CTCs的检出率为67.5%(54/80)，混合型CTCs的检出率为72.5%(58/80)，见图1。

2外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞的流式细胞术检测结果

原发性肝癌患者外周血的CD4+T细胞和CD8+T细胞经流式细胞术检测结果见图2。图中右上象限分别为CD4+T细胞和CD8+T细胞的检测情况。

Figure 1.Observation of the epithelial CTCs (A), mesenchymal CTCs (B) and hybrid CTCs (C) in the peripheral blood by the method of CanPatrolTM(immunofluorescence，×200).

图1CanPatrolTM法检测外周血中的CTCs

Figure 2.The images of the flow cytometry analysis for determining CD4+T cells and CD8+T cells．

图2CD4+T细胞和CD8+T细胞的流式细胞术检测图

3外周血中CTCs与CD4+/CD8+比值的关系

高CD4+/CD8+组的间质型CTCs及CTCs总数较低CD4+/CD8+组明显减少，两组之间CTCs数的差异有统计学显著性(P<0.05)；而外周血中的上皮型CTCs数及混合型CTCs数在2组之间的差异无统计学显著性，见表1。

*P<0.05,**P<0.01vshigh CD4+/CD8+group.

4CTCs与TTV及肿瘤分期的关系

高TTV组的CTCs总数、间质型CTCs及混合型CTCs数目明显高于低TTV组，2组之间差异有统计学显著性(P<0.05)，而2组上皮型CTCs数目的差异无统计学显著性,见表2；肿瘤分期Ⅰ+Ⅱ期组患者外周血的CTCs总数、间质型CTCs及混合型CTCs数目均低于Ⅲ+Ⅳ期组，2组之间的差异有统计学显著性(P<0.05)，而2组上皮型CTCs数目的差异无统计学显著性，见表3。

5NLR与CTCs的关系

研究结果表明高NLR组和低NLR组间的外周血中CTCs总数、间质型CTCs、混合型CTCs及上皮型CTCs数目的差异均无统计学显著性，见表4。

*P<0.05,**P<0.01vshigh TTV group.

*P<0.05vsI+II group.

讨论

1869 年Ashworth 从血液中发现有一种血细胞同尸检发现的肿瘤细胞相似，首次提出CTCs 这一概念[2]。进入循环系统的CTCs 绝大多数在机体的免疫作用下发生凋亡，少数可以存活下来，形成转移灶。尽管如此，CTCs 具有与原发灶相似乃至相同性质特征，因此可以作为一种代表原发肿瘤的“液态活检标本”。检测外周血中的CTCs，有助于肝癌 的早期诊断、有助于对复发与转移的监测和对预后的预测，有助于治疗手段的选择以及优化。研究表明，外周血中CTCs存在不同型别，间质型CTCs比上皮型CTCs和混合型CTCs具有更强的侵袭、转移能力，外周血中检测出间质型CTCs，则肿瘤发生恶化、复发、转移的风险明显增高[5]。

机体的免疫功能与肿瘤的发生、发展密切相关。而在机体抗肿瘤免疫中，T细胞免疫发挥关键作用。研究证实，肝癌的发生发展、预后与机体的免疫状态密切相关[6-7]。肝癌患者存在CD4+/CD8+比值失衡，CD4+/CD8+比值可反映机体T细胞免疫功能，比值越低表示T细胞免疫功能越差[8]。本研究表明高CD4+/CD8+比值组，外周血CTCs总数及间质型CTCs、混合型CTCs数目显著低于低CD4+/CD8+比值组，这一方面可能与CD4+T淋巴细胞减少，而抑制性CD8+T淋巴细胞增多，更加抑制机体的免疫应答反应及杀伤效应，对外周血的CTCs的识别能力及杀伤清除能力明显下降有关；另一方面，研究显示肿瘤细胞在进入循环系统时需经过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[9]，间质化后的肿瘤细胞具有更强的侵袭能力，使其更容易侵入血管进入血液；在上述转化过程中，肿瘤细胞可能通过细胞表面抗原成分改变逃避机体免疫监视而避免被机体消灭。本研究表明，T细胞免疫功能越差，肝癌患者CTCs就越多，特别是更强的侵袭和转移能力的CTCs增多，是引起肝癌复发和转移的重要原因。

TTV是临床用于评估肿瘤负荷的新型指标，比起单纯使用肿瘤最大直径及肿瘤个数相比，TTV更能准确反映肿瘤负荷[10]。随TTV的增加，肝癌患者的死亡风险比呈进行性升高[11]；本研究表明高TTV组肝癌患者外周血CTCs总数、间质型及混合型CTCs数目明显高于低TTV组患者，可能是随着TTV不断增大，肿瘤细胞不断增殖，通过EMT等形态学变化，细胞会分泌胞外酶降解细胞外基质，造成细胞间及细胞与周围基质间相互附着力下降，从而利于肿瘤细胞逃离组织束缚进入循环系统形成CTCs。TTV大的患者预后较差，可能与患者外周血中CTCs增多密切相关。TNM分期是目前临床上用于肝癌最常用的的分期方法之一，分期越晚提示预后越差，我们研究结果认为Ⅲ、Ⅳ期患者外周血CTCs总数、间质型及混合型CTCs数目明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者，上述结果可充分解释分期越晚预后越差，但临床上部分I期患者术后早期内出现复发转移，而且我们在检测CTCs时发现部分I期患者外周CTCs数量较多，提示TNM分期存在一定误差，导致部分晚期患者被误认为早期，从而耽误患者治疗。本研究表明外周血CTCs类型、数目与TNM分期关系密切，因此也许可将外周血CTCs作为TNM分期的一项指标，从而进一步减少TNM分期与临床之差异。

研究表明炎症在肿瘤的发生、发展过程中发挥了重要的作用，机体炎症程度与肿瘤患者的预后有密切关系[12]。NLR作为一个评估中性粒细胞与淋巴细胞相对水平的免疫学指标, 能反映机体中促瘤性炎症反应与抗瘤性炎症反应的平衡关系，有研究表明NLR是肝癌的独立预后因素，NLR相对较高的患者预后差[13]。本研究表明外周血CTCs类型、数目与NLR无明显关联，但我们发现NLR高组外周血CTCs数目较低组要少，提示体内适当的抗肿瘤炎症存在有利于消灭外周血CTCs。

总之，肝癌患者外周血中存在CTCs，而外周血CTCs与TTV及肿瘤分期存在正相关关系，与T细胞免疫存在负相关关系，患者T细胞免疫功能越差、TTV越大及肿瘤分期越晚，外周血中CTCs数量及恶性程度高的间质型CTCs数目、混合型CTCs数目明显增多，因此我们可通过提高患者免疫功能及减少肿瘤负荷而改善患者预后。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

Relationship of CTCs with CD4+/CD8+, NLR, TTV and tumor stage in patients with primary hepatocellular carcinoma

WAN Lei, CHEN Jia-jia, LIU Jian-jun, KAN He-ping

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:khp5513@126.com)

[KEY WORDS]Hepatocellular carcinoma; Circulating tumor cells; T-cell immune; Total tumor volume; Neutrophil-to-lymphocyte ratio; Tumor stage

[ABSTRACT]AIM: To explore the relationship of circulating tumor cells (CTCs) with CD4+/CD8+, neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR), total tumor volume (TTV) and tumor stage in the patients with primary hepatocellular carcinoma.METHODS: We selected 80 cases of histologically diagnosed primary hepatocellular carcinoma in the study. The method of CanPatrolTMwas used, which was developed by SurExam biotechnology company to identify CTCs in the blood. CD4+T cells and CD8+T cells were counted by flow cytometry. The patients were divided into 2 groups according to the levels of CD4+/CD8+ratio, NLR and TTV. The patients were also divided into Ⅰ+ Ⅱstage group and Ⅲ+ Ⅳ stage group according to the seventh edition of TMN staging criteria.RESULTS: The numbers of peripheral blood CTCs and mesenchymal CTCs in high CD4+/CD8+ratio group were significantly lower than those in low CD4+/CD8+ratio group (P<0.05). The numbers of peripheral blood CTCs, mesenchymal CTCs and hybrid CTCs in high TTV group were significantly higher than those in low TTV group (P<0.05). The numbers of peripheral blood CTCs, mesenchymal CTCs and hybrid CTCs in I+ II stage group were significantly lower than those in III+ IV stage group (P<0.05). The numbers of peripheral blood CTCs, mesenchymal CTCs, hybrid CTCs and epithelial CTCs between high NLR group and low NLR group had no statistical difference.CONCLUSION: CTCs exist in the peripheral blood of the patients with primary hepatocellular carcinoma. The peripheral blood CTCs have significant correlations with TTV, tumor stage and T-cell immunity．The worse cell immune function, the larger TTV and the later tumor stage a patient has, the more the peripheral blood CTCs are.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1017- 05

[收稿日期]2016- 04- 08[修回日期] 2016- 04- 29

*[基金项目]广东省自然科学基金资助项目(No.S2012020010942)

通讯作者△Tel: 020-61641706; E-mail: khp5513@126.com

[中图分类号]R730．23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.009