蜂胶醇提物通过抑制caspase-12减轻氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡*

李严严，　徐晓燕，　张家君，　方永奇，　田　华，　焦　鹏，　桑　慧, ，　秦树存△，　姚树桐, △

(泰山医学院 1动脉粥样硬化研究所，山东省高校动脉粥样硬化重点实验室,2药学院, 3附属医院， 4基础医学院，山东 泰安 271000)



蜂胶醇提物通过抑制caspase-12减轻氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡*

李严严1▲，徐晓燕2▲，张家君3，方永奇4，田华1，焦鹏1，桑慧1, 4，秦树存1△，姚树桐1, 4△

(泰山医学院1动脉粥样硬化研究所，山东省高校动脉粥样硬化重点实验室,2药学院,3附属医院，4基础医学院，山东 泰安 271000)

[摘要]目的： 研究蜂胶醇取物(ethanol extract of propolis，EEP)对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)诱导的巨噬细胞凋亡的抑制作用，并探讨可能的分子机制。方法: 体外培养RAW264.7巨噬细胞，给予EEP(7.5、15和30 mg/L)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA；5 mmol/L)或二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodo-nium，DPI；5 μmol/L)预处理1 h，再加入ox-LDL(100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin，TM；4 mg/L)继续培养24 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC双染法检测细胞活力和凋亡情况；试剂盒测定细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的水平。采用免疫印迹技术检测内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途径关键蛋白caspase-12的表达变化。结果: 与ERS抑制剂PBA相似，EEP呈剂量依赖性减轻ox-LDL所致的巨噬细胞损伤，表现为细胞活力增加(P<0.01)，凋亡率降低(P<0.05)，且可抑制ERS诱导剂TM所引起的巨噬细胞活力下降和凋亡(P<0.05)；与氧化应激抑制剂DPI相似，EEP可抑制ox-LDL诱导的氧化应激反应，表现为ROS和MDA生成减少(P<0.01)，SOD活性增加(P<0.05)；EEP显著抑制ox-LDL和TM所诱导的caspase-12活化(P<0.05)；与ox-LDL组比较，PBA和DPI预处理组caspase-12活性也受到明显抑制(P<0.01)。结论: EEP可减轻 ox-LDL 所诱导的RAW264.7巨噬细胞凋亡，其机制可能与抑制氧化应激和caspase-12活化有关。

[关键词]蜂胶醇取物； 半胱天冬酶12； 氧化低密度脂蛋白； 巨噬细胞； 细胞凋亡

巨噬细胞凋亡是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块的重要病理学特征和造成斑块不稳定的决定性因素，进而导致急性心血管事件如急性心肌梗死和心源性猝死的发生[1]。因此，减轻巨噬细胞凋亡被认为是增强AS斑块稳定性、降低急性血管事件发生率的有效途径[2]。蜂胶是蜜蜂采集植物幼芽分泌物、树脂等并混入其上鄂腺分泌物混合加工而成的一种胶状物，因其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、调节血糖和机体免疫功能等药理作用而广泛应用于传统医学[3]。研究表明富含黄酮类化合物的蜂胶醇取物(ethanol extract of propolis，EEP)可抑制巨噬细胞介导的炎症反应[4]。本室既往研究证实，EEP促进胆固醇逆向转运、抑制AS病变发展[5-6]，且新近研究表明EEP可通过抑制凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)介导的氧化应激减轻氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)诱导的内皮细胞损伤[7]。然而EEP是否可减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞凋亡？其机制是否通过抑制caspase-12介导的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途径实现？上述问题的解决将为深入认识蜂胶的抗AS作用机制提供新的思路。本工作分别在ox-LDL和ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin，TM)诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤模型上研究EEP对细胞凋亡和caspase-12活化的影响，探讨其对巨噬细胞的保护作用及机制。

材料和方法

1试剂

2’, 7’-二氯荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCHF-DA)购自Molecular Probes；抗β-actin抗体、TM、4-苯丁酸(4-phenylbuty-ric acid，PBA)和二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodo-nium，DPI)购自Sigma；DMEM高糖培养基和RIPA裂解液分别购自Gibco和Solarbio；四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]和 Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒分别购自Genview和南京凯基生物科技公司；兔抗caspase-12多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG分别为Abcam和北京中杉金桥公司产品；增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒和二氟化树脂(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜分别为Pierce和Millpore产品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其余试剂均为分析纯产品。

2方法

2.1EEP的制备和总黄酮测定采集新鲜泰山松柏蜂胶，烘干、粉碎，按本室既往报道的方法[7]制备EEP。取100克蜂胶溶于1升95%乙醇中，40 ℃超声处理3 h。然后将上清液用滤纸过滤，收集残渣，用95%乙醇再提取2次。合并上清液，50 ℃条件下经减压旋转蒸发器蒸发。然后在烘箱中干燥，-20 ℃保存。按照国家标准分光光度比色法(GB/T 20574-2006)测定EEP总黄酮含量，结果为(213.46±2.93)mg芦丁当量/g。使用前将EEP溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，并用细胞培养基稀释成适当浓度。

2.2ox-LDL的制备按照本室既往报道的方法[8]制备ox-LDL，即采用序列超速离心法分离健康人新鲜血浆LDL，并与10 μmol/L CuSO437 ℃孵育18 h。测定硫代巴比妥酸反应物质 MDA 浓度>30 μmol/g，且琼脂糖凝胶电泳显示ox-LDL电泳迁移率增快，为LDL的2.0～2.5倍。

2.3细胞培养与实验分组鼠源RAW264.7巨噬细胞由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供，用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)于5% CO2培养箱中37 ℃培养。随机分为：(1)正常对照(control)组：培养液中常规培养；(2)ox-LDL组：培养液中加入100 mg/L ox-LDL；(3)EEP预处理组：培养液中先加入EEP(7.5、15和30 mg/L)预处理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(4)ERS抑制剂PBA预处理组：培养液中先加入5 mmol/L PBA预处理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(5)氧化应激抑制剂DPI预处理组：培养液中先加入5 μmol/L DPI预处理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。另外培养RAW264.7巨噬细胞，先给予30 mg/L EEP预处理1 h，然后与ERS诱导剂TM(4 mg/L)共孵育24 h。除EEP预处理组和TM组外，其它各组均加入0.1%的DMSO，培养 24 h 收集细胞。

2.4MTT法检测细胞活力将细胞接种于96孔培养板，经处理后每孔加入0.5 g/L的MTT，避光37 ℃培养4 h，弃培养基，每孔加入150 μL DMSO，置水平摇床振荡10 min，用多功能酶标仪(Tecan)在490 nm处测定吸光度(A)。以正常对照组细胞活力为100%，其余各组细胞活力以其A值占正常对照组A值的百分比表示。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡用Annexin V-FITC/PI双染色法分析细胞凋亡情况。细胞经处理后，收集并重悬于500 μL上样缓冲液，与5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)室温避光孵育15 min。细胞凋亡率由流式细胞仪(Becton-Dickinson)分析测定。总细胞凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin+/PI+)。

2.6活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的测定将细胞接种于96孔板，经处理后，装载探针，使DCHF-DA终浓度为10 μmol/L。37 ℃孵育30 min后，无血清培养液洗细胞3次。多功能酶标仪检测，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。以对照组ROS水平为100%，其它各组ROS水平以其荧光强度占对照组荧光强度的百分比表示。

2.7SOD活性和MDA含量的测定细胞经处理后，收集并重悬于0.5 mL裂解缓冲液中充分裂解，1 500 r/min离心10 min，取上清液检测SOD活性和MDA含量，分别用×103U/g protein和μmol/g protein表示，实验操作按照试剂盒说明书进行。

2.8免疫印迹分析按本室既往报道的方法[9]提取细胞总蛋白，等量的各组总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移至PVDF膜上，经封闭、洗脱后与caspase-12多克隆抗体(1∶1 000)和β-actin(1∶6 000)单克隆抗体室温孵育4 h，洗膜后与辣根过氧化物酶标记的相应 II 抗室温孵育1 h。抗原-抗体复合物用ECL法显示，应用化学发光成像仪(上海欧翔科学仪器有限公司)进行图像采集。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(Media Cybernetics)分析蛋白条带积分吸光度(IA)值，以靶蛋白IA值/β-actinIA值的比值反映靶蛋白相对水平。

3统计学处理

结果用平均值±标准差(mean±SD)来表示。应用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差(one-way ANOVA)分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1EEP抑制ox-LDL诱导的RAW264.7细胞活力降低

MTT结果显示，以100 mg/L ox-LDL处理24 h，细胞活力降低为正常对照组的55.3%(P<0.01)，而EEP则明显减轻ox-LDL所诱导的细胞毒性，呈剂量依赖性(P<0.01)，且其对细胞的保护作用与ERS抑制剂PBA相似，见图1。

Figure 1.EEP inhibited ox-LDL-induced decrease in viability of RAW264.7 cells. The cells were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L) or PBA (5 mmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h. The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

图1蜂胶醇提物抑制ox-LDL所诱导的RAW264.7巨噬细胞活力降低

2EEP抑制TM诱导的RAW264.7细胞活力降低

ERS诱导剂TM明显造成巨噬细胞损伤，其细胞活力较正常对照组降低38.3%(P<0.01)；而以30 mg/L EEP预处理后，细胞活力较TM组明显升高(P<0.05)，见图2。

Figure 2.EEP inhibited TM-induced decrease in viability of RAW264.7 cells. The cells were pretreated with EEP (30 mg/L) for 1 h and then treated to TM (4 mg/L) for 24 h. The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

图2蜂胶醇提物抑制TM所诱导的RAW264.7巨噬细胞活力降低

3EEP抑制ox-LDL诱导的RAW264.7细胞凋亡

以100 mg/L ox-LDL处理24 h，细胞凋亡率是正常对照组的3.37倍(P<0.01)，而EEP则明显减轻ox-LDL所诱导的细胞凋亡，以30 mg/L EEP预处理组最为明显(P<0.05)，且其对细胞凋亡的抑制作用与ERS抑制剂PBA相似，见图3。

4EEP抑制TM诱导的RAW264.7细胞凋亡

与正常对照组比较，ERS诱导剂TM处理组细胞凋亡率显著增加(P<0.01)；而以30 mg/L EEP预处理后，细胞凋亡率较TM组明显降低(P<0.05)，见图4。

5EEP抑制ox-LDL诱导的caspase-12活化

采用可同时识别caspase-12 酶原(procaspase-12)和剪切活化形式caspase-12(cleavedcaspase-12)的特异性抗体，进行免疫印迹检测，以经β-actin校准后的cleaved caspase-12条带IA值表示caspase-12活化的相对水平。结果显示ox-LDL处理组cleaved caspase-12水平较正常对照组显著增加(P<0.01)；而EEP则明显减轻ox-LDL所诱导的caspase-12活化(P<0.05)，且其作用与ERS抑制剂PBA和氧化应激抑制剂DPI相似，见图5。

Figure 3.EEP inhibited ox-LDL-induced apoptosis of RAW264.7 cells. The cells were treated as described in Figure 1. Cell apoptosis was detected by flow cytometry and the total apoptotic cells (early and late-stage apoptosis) were represented by the right side of the panel (Annexin V staining alone or together with PI). Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsox-LDL group.

图3蜂胶醇提物抑制ox-LDL所诱导的RAW264.7巨噬细胞凋亡

Figure 4.EEP inhibited TM-induced apoptosis of RAW264.7 cells. The cells were treated as described in Figure 2, and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

图4蜂胶醇提物抑制TM所诱导的RAW264.7巨噬细胞凋亡

Figure 5.EEP inhibited ox-LDL-induced activation of caspase-12. The RAW264.7 cells were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L), PBA (5 mmol/L)or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h. The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

图5蜂胶醇提物抑制ox-LDL所诱导的caspase-12活化

6EEP抑制TM诱导的caspase-12活化

TM处理组cleaved caspase-12水平较正常对照组显著增加(P<0.01)；而以30 mg/L EEP预处理后，则明显抑制TM所诱导的caspase-12活化(P<0.05)，见图6。

Figure 6.EEP inhibited TM-induced activation of caspase-12. The RAW264.7 cells were treated as described in Figure 2, and the protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

图6蜂胶醇提物抑制TM所诱导的caspase-12活化

7EEP抑制ox-LDL诱导的氧化应激反应

如表1所示，与正常对照组比较，ox-LDL处理组ROS和MDA水平显著增加(P<0.01)，SOD活性显著降低(P<0.01)；而与氧化应激抑制剂DPI相似，以30 mg/L EEP预处理则显著抑制ox-LDL所诱导的氧化应激反应，表现为ROS和MDA生成减少(P<0.01)，SOD活性增加(P<0.05)。

表1　蜂胶醇提物对ox-LDL所致氧化应激反应的影响

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

讨论

AS是一个复杂的多细胞参与的慢性炎症性病理过程，其中巨噬细胞与AS进展尤其与晚期粥样斑块的破裂密切相关。巨噬细胞凋亡不仅直接导致凋亡的平滑肌细胞和巨噬细胞不能被有效吞噬，促进脂质核心的形成及增大，而且富含游离胆固醇的凋亡巨噬细胞通过释放基质降解蛋白酶损伤纤维帽，并产生白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α等炎症因子，引起继发性炎症反应和坏死，从而促进斑块不稳定[1]。研究表明，EEP可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所诱导的巨噬细胞中一氧化氮(nitric oxide，NO)、IL-1β和IL-6等炎症因子的生成与释放[4, 10]，并可减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤[7]。本实验结果显示，给予ox-LDL处理RAW264.7巨噬细胞24 h，细胞活力降低，凋亡率显著增加，而EEP则明显减轻ox-LDL所引起的巨噬细胞损伤，表现为细胞活力增加，凋亡率降低，且呈浓度依赖性，表明EEP对ox-LDL所诱导的巨噬细胞损伤具有保护作用。

目前已知细胞凋亡调控机制除死亡受体途径和线粒体途径外，越来越多证据表明内质网也是损伤感知或凋亡信号整合的主要位点，因而提出了内质网凋亡途径。内质网是调控细胞内蛋白合成、折叠和钙稳态的重要细胞器，其对环境变化十分敏感，氧化应激、钙稳态失衡、胆固醇超负荷等理化改变均可导致内质网功能紊乱，出现以未折叠/错误折叠蛋白聚集和钙稳态失衡为主要特征的ERS反应。一定程度ERS通过暂时性抑制蛋白合成、激活内质网相关蛋白降解途径和上调糖调节蛋白78(glucose-regulated proteins 78，GRP78)、GRP94等分子伴侣调控内质网功能，维持细胞生存。但是过强或长时间ERS则可触发细胞凋亡，导致不可逆损伤，其中caspase-12是介导ERS相关凋亡途径的重要分子之一[11]。在静息状态下，caspase-12以酶原形式存在于内质网膜胞浆侧，而在ERS时被特异激活，通过激活caspase-9和caspase-3而诱导细胞凋亡[12]。来自人脐静脉内皮细胞的研究表明，ox-LDL通过激活caspase-12诱导细胞凋亡[13]。我们前期工作证实ERS-C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)信号途径介导ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡，而载脂蛋白A1模拟肽D4F可通过抑制该信号途径减轻ox-LDL对巨噬细胞凋亡的诱导作用[8, 14]。本实验结果显示，EEP对ox-LDL所诱导的巨噬细胞损伤的保护作用与ERS抑制剂PBA相似，而且可减轻ERS诱导剂TM所诱导的细胞活力降低和凋亡率增加。另外，与PBA相似，EEP不仅可抑制ox-LDL所诱导的caspase-12活化而且可减轻TM所诱导的caspase-12活化，表明EEP可通过抑制caspase-12活化减轻ox-LDL所诱导的巨噬细胞凋亡。

氧化应激是引起ERS反应的重要因素之一[15]。研究表明ox-LDL主要氧化脂质成分7-酮胆甾醇(7-ketocholesterol，7-KC)可通过氧化应激触发人动脉平滑肌细胞ERS的发生[16]。本实验结果显示，氧化应激抑制剂DPI可抑制ox-LDL所诱导的caspase-12活化，进一步证实ox-LDL通过氧化应激反应激活caspase-12介导的ERS凋亡信号途径。我们既往研究证实，EEP可通过抑制LOX-1介导的氧化应激减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤[7]。本实验结果显示，与DPI相似，EEP可抑制ox-LDL所诱导的ROS和MDA生成，上调SOD活性，提示EEP对caspase-12介导的ERS凋亡途径的抑制作用与减轻氧化应激有关。

综上所述，本研究发现EEP可减轻 ox-LDL 所诱导的RAW264.7巨噬细胞凋亡，其机制可能与抑制氧化应激和caspase-12活化有关。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

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《中国病理生理杂志》编辑部

2015年12月15日

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81260025； No. 30800467)

Ethanol extract of propolis protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting caspase-12LI Yan-yan1, XU Xiao-yan2, ZHANG Jia-jun3, FANG Yong-qi4, TIAN Hua1, JIAO Peng1, SANG Hui1, 4, QIN Shu-cun1, YAO Shu-tong1, 4

(1InstituteofAtherosclerosis,KeyLaboratoryofAtherosclerosisinUniversitiesofShandong,2CollegeofPharmacy,3AffiliatedHospital,4CollegeofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China.E-mail:shucunqin@hotmail.com;yst228@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the inhibitory effect of ethanol extract of propolis (EEP) on oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced macrophage apoptosis and the underlying molecular mechanisms. METHODS: RAW264.7 macrophages were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L), 4-phenylbutyric acid (PBA, 5 mmol/L) or diphenyleneiodonium (DPI, 5 μmol/L) for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) or tunicamycin (TM, 4 mg/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and Annexin V-FITC apoptosis detection kit, respectively. The activity of superoxide dismutase (SOD), and the levels of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) in the cells were measured. The protein levels of caspase-12, a proapoptotic molecule under endoplasmic reticulum stress (ERS), were examined by Western blot analysis. RESULTS: Like PBA (an ERS inhibitor), EEP protected RAW264.7 macrophages from ox-LDL-induced injury in a dose-dependent manner, as assessed by the increased cell viability and the decreased apoptotic rate. The decrease in cell viability and increase in apoptotic rate induced by TM, an ERS inducer, were also attenuated by EEP. Moreover, EEP suppressed ox-LDL-induced oxidative stress as revealed by the decreased generation of ROS and MDA as well as elevated SOD activity, which were similar to DPI, an oxidative stress inhibitor. Furthermore, EEP significantly suppressed ox-LDL- or TM-induced activation of caspase-12. Similar results were observed in the cells pretreated with PBA or DPI and then treated with ox-LDL. CONCLUSION: EEP may protect RAW264.7 macrophages from ox-LDL-induced apoptosis and the mechanism is at least partially involved in the ability of EEP to suppress oxidative stress and subsequent activation of caspase-12.

[KEY WORDS]Ethanol extract of propolis; Caspase-12; Oxidized low-density lipoprotein; Macrophages; Apoptosis

通讯作者△Tel: 0791-86300545; E-mail: wuyanqing01@sina.com.cn

[收稿日期]2015- 03- 18[修回日期] 2015- 10- 27

[文章编号]1000- 4718(2015)12- 2209- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.015

[中图分类号]R285.5； R363.2

[文献标志码]A