线粒体钙单向转运体及其蛋白相互作用的调控*



线粒体钙离子平衡对维持线粒体特性，介导多种细胞生理功能和病理过程具有重要的作用。虽然大家都知道线粒体钙离子的摄取，但直到近年来才部分揭示此过程中转运体的分子结构。本文就线粒体钙离子单向转运体(mitochondrial calcium unipor-ter，MCU)及其相互作用蛋白的研究进展进行综述。

1MCU的分子结构

MCU核基因位于10号染色体，编码的蛋白质为40 kD，此蛋白在线粒体摄取期间转化为35 kD蛋白质的成熟形式。MCU具有2个跨膜的α-螺旋结构，这结构在不同的物种间高度保守。其N和C末端结构域跨膜进入线粒体基质中， MCU的9-aa连接器面对着两膜间隙[1]。利用APEX检测发现，APEX仅与MCU的N和C末端融合，使线粒体基质明显着色，但线粒体膜间隙没有着色[2]。研究发现，MCU低聚物可能形成一个具有功能活性的单向转运体通道，此通道由四聚体构成，其中8个螺旋沿着假设的通道区域排列，通道的邻近区域排列着成串的带电氨基酸残基，并产生负电势，这有利于阳离子通过[3]。在线粒体DIME区域中，人类MCU的D261/E264两个带负电荷的氨基酸残基发生突变，可以导致MCU失活，而使功能降低[1, 4]。

2MCU的线粒体Ca2+的单向转运机制

线粒体快速转运钙离子穿过线粒体膜，并在线粒体内存有钙离子效应器的基质中积聚[5]。驱使线粒体钙离子吸收的动力是线粒体膜电位(Δψm)，整个线粒体内膜中均存有这膜电势，它是由呼吸链复合物产生并由进入线粒体内膜的质子泵形成的一电化学势能梯度。线粒体通过MCU进行顺电化学势能吸收Ca2+。MCU复合物的主要特性是对钙离子具有很低的亲和力，生理条件下平衡离解常数 (dissociation constant，Kd)仅为20～30 μmol/L。胞质钙离子浓度约在5～10 μmol/L之间可以形成相当大的线粒体钙离子内流，但在健康的活细胞中从没有观察到胞质具有如此的钙离子浓度。然而有研究表明，线粒体与内质网膜在结构上临近，在线粒体和内质网钙离子通道间的紧密位置能形成瞬间高浓度钙离子的微区[6-7]，确保了MCU复合物对胞质钙离子吸收所需要的高钙离子浓度，进而将Ca2+转运至线粒体内，并在线粒体内迅速积聚(图1)。

Figure 1.The structure and function of mitochondrial calcium uniporter complex.

图1线粒体钙单向转运孔复合体的结构和功能

De Stefani等[4]把纯化的CCDC109A/MCU重构入一个平面的脂双层中，发现产生了Ca2+离子流，该Ca2+离子流的特性与先前Clapham等报道MCU与Ca2+离子流密切相关并促进了Ca2+摄取的结论类似。新近Chaudhuri等[8]应用线粒体膜片钳技术证实和更新了这一观点，他们发现通过基因敲除使人过表达MCU，则明显改变相应的线粒体钙离子流的变化。而MCU-S259A基因突变则损害了MCU对Ca2+的转运，改变了钌红的敏感性[1, 8]。这些结果表明MCU直接编码了单向转运体通道的亚单位，且钌红对此转运通道具有抑制效应。将MCU过表达，可使线粒体钙离子摄取加倍，进而引起细胞质钙离子浓度显著降低[1, 4]。在MCU敲除的细胞中重新引进野生型蛋白可完全恢复了钙离子的吸收[1]。

3MCU相互作用蛋白的调控

生理状况下，MCU并非单独行使功能，而是与MICU1、MICU2、MCUR1和MICUb等调节蛋白相互作用，形成大分子复合物，共同参与线粒体Ca2+的转运，由于相互作用蛋白不同，其发挥的效应也不尽相同。

3.1MICU1的结构与调控实际上，MICU1以前称为CBARA1和EFHA3，发现先于MCU[9]。Mootha小组正是利用MICU1作为分子探针，确定了MCU是单向转运体的核心组成部分。在各种小鼠组织中MCU和MICU1均显示出相同的进化模式和类似的RNA表达[10]。MICU1是一个54 kD的单跨膜蛋白，含有2个高度保守的EF臂Ca2+结合结构域。MICU1在大多数哺乳动物组织中均有表达，但在酵母中没有发现。MICU1位于线粒体内膜(inner mitochondrial membrane，IMM)的外表面，面对膜内间隙[11]。MICU1下调可减少线粒体Ca2+含量，但并没有明显损害线粒体呼吸和膜电位[12]。Csordas等[11]发现MICU1在细胞内高Ca2+条件下有助于单向转运体的激活。Foskett和Madesh等提出MICU1对MCU依赖性Ca2+积累具有重要作用。与上述结果相反，Mallilankaraman等[13]利用敲除MICU1的细胞，发现组胺诱导线粒体的Ca2+摄取不变，而且显著增加线粒体Ca2+浓度。因此推测，在静息或弱刺激状态下，当细胞内Ca2+浓度较低时，MICU1可能限制MCU对Ca2+的转运。当MICU1缺失，线粒体Ca2+处于超载状态。Csordas等[11]认为MICU1在MCU介导的Ca2+摄取中起到一个Ca2+高亲和闸门作用，而这种作用与所谓的Ca2+摄取快速模式(RAM)相关联。在这种模式下，加入Ca2+时，MCU最初非常迅速吸收Ca2+，当线粒体基质内Ca2+增加时，MICU1通过EF臂区域结Ca2+，对MCU依赖性Ca2+内流起到了抑制作用[12]。总之，一方面MICU1稳定了MCU复合物，限制了静息条件下线粒体钙离子的摄取，或者通过MICU1与Ca2+结合，限制了线粒体钙离子的进入。另一方面，MICU1也可能与MCU协同使Ca2+进入线粒体内，确切转运及其机制还有待进一步研究证明之。

3.2MICU2的结构与调控MICU1有2个同源体，即人基因EFHA1和EFHA2的蛋白产物，此类蛋白与MICU1的序列有25%同源性。这2种蛋白质都具有N末端线粒体的靶向定位序列，并在多个小鼠组织中都能检测到。它们分别被命名为MICU 2和MICU3[14]。由于MICU 3在线粒体中没有明显的特定定位，所以目前被排除在列表之外[15]。MICU2在线粒体中则有明确定位，与MICU1类似，具有高度保守的EF臂结构域。MICU2与MICU1和MCU相互作用[14]，与MICU1类似，MICU2应该位于线粒体膜间隙(intermembrane space，IMS)，在线粒体基质蛋白中没有发现[16]。体内沉默MICU2不影响ΔΨm或线粒体呼吸链，但可增加线粒体Ca2+的难度[14]。MICU2沉默可以发现线粒体Ca2+降低，且在MICU1沉默的HeLa细胞中，若使MICU2过表达，则可恢复线粒体的Ca2+摄取，其表型更接近于野生型。研究表明MICU1、MICU2和MCU均位于同一复合物中[14]。它们之间相互协同，如在小鼠肝脏细胞中，用siRNAs沉默MICU1和MICU2可导致MCU蛋白表达降低，并且MCU复合物的大小发生转变；在HEK293细胞中，MICU1敲除可导致MICU2水平的降低。此外，MCU的过表达可增加MICU1和MICU2表达；在HeLa细胞中，MICU1下调导致MICU2蛋白水平降低，反之亦然。

3.3MCUb的结构与调控MCUb(以前为CCDC109B)是MCU的同源体，为一个33 kD的蛋白，与MCU具有50%的相似性。它的蛋白质拓扑结构与MCU非常相似，同样有2个面对着IMS的 N和C末端的跨膜结构域，但MCUb 表达水平较低，表达谱也有所不同，与MCU相比较， MCUb的mRNA水平是很低的。MCUb mRNA在心脏和肺组织中有很高的表达，但在骨骼肌组织中表达少。MCU与MCUb相互作用，在完整细胞中，MCUb的过表达可减少线粒体Ca2+摄取。MCUb表现为一种内源性负性显性特征。在复合物中，插入一个或多个MCUb亚基，将延缓线粒体对Ca2+的摄取[3]。

3.4MCUR1的结构与调控研究表明线粒体Ca2+单向转运体调节子1在45类线粒体蛋白中进行siRNA扫描，发现它是控制Ca2+吸收的必需调节子，主要存在于IMM上，包含2个跨膜区域和1个螺旋线圈区域。通过使用蛋白酶K生化法确定了MCUR1的拓扑结构，它的N和C末端残基的突出进入IMS中，提示MCUR1可能为线粒体基质蛋白中重要组成，对线粒体Ca2+摄取和基质内Ca2+稳态中起着重要作用。MCUR1沉默导致线粒体内Ca2+浓度减少。有实验研究表明，MCUR1与MCU相互作用，但不与MICU1相互作用[17]。在HeLa细胞中过表达MCUR1可增加线粒体内Ca2+浓度。同样，在MCUR1沉默的细胞中，MCU的过表达未能恢复Ca2+的含量，表明这MCU和MCUR1对于Ca2+转运存在关联性。值得注意的是，在MCUR1耗竭的细胞中，MCU的mRNA和蛋白表达是上调的，提示2种蛋白间可能存在某种依存关系。

3.5EMRE的结构与调控EMRE(以前称为C22ORF32)，是单向转运体复合物的一个组成部分[18]，为10 kD的单跨膜蛋白，位于IMM上，具有高度保守的富含有天冬氨酸C末端区域[19]。值得注意的是，在任何植物、原生动物和真菌中均未发现其同源物，表明EMRE是一个后生多细胞动物的进化产物。EMRE与IMS中的MICU1和内膜上的MCU低聚物相互作用，可能在MICU1/MICU2和MCU之间起到桥梁作用。EMRE下调可使线粒体内Ca2+显著降低，提示线粒体Ca2+摄取需要EMRE的参与[19]。在EMRE沉默的细胞中，过表达MCU并不能恢复线粒体Ca2+吸收，也提示二者存在相互作用。EMRE蛋白的表达是严格依赖于MCU的多少，作为一个分子伴侣，可能类似于MICU1/MICU2。在MCU耗竭的细胞中，尽管mRNA水平没有改变，但EMRE蛋白含量急剧下降。

4MCU复合物的病理生理学意义

现在认为线粒体内游离Ca2+浓度发挥着重要的生理病理作用，如细胞内的能量调节、细胞内Ca2+信号调控及缺血再灌注损伤等，特别对Ca2+平衡的调节，起着核心作用。线粒体Ca2+摄取在有氧代谢[20]和细胞存活[21]的调控过程中起着关键的作用。几种癌基因和肿瘤抑制因子调控着Ca2+发挥其抗/促凋亡的活性，并且线粒体Ca2+超载在许多病理状态中与细胞凋亡或坏死相关联[21]。在促凋亡刺激的条件下，过表达MCU的细胞表现出增强了细胞凋亡的效应，说明增加MCU与细胞死亡的易感性具有相关性[3]，而Marchi等[22]研究显示，在MCU的表达和细胞凋亡的过程中有miRNA调控的参与。下调MCU后，线粒体Ca2+摄取，这使线粒体Ca2+含量降低，Ca2+依赖的细胞凋亡减弱[22]。 除了癌症，在心肌细胞中，沉默MCU基因，胞内Ca2+浓度显著增加，并与增加收缩反应有相关性[23]。在缺血再灌注损伤和心肌梗死时，CaMKII通过增加MCU复合体的活性，促进心肌细胞凋亡，降低心肌功能[24]。其可能的机制是，CaMKII在基质中与MCU相互作用，促进MCU丝氨酸57和92磷酸化，增加MCU的功能所致[24]。在胰腺β细胞中，MCU和MICU1依赖的Ca2+积聚将调节ATP水平、葡萄糖代谢和胰岛素分泌[25-26]。有报道MCU沉默将损害葡萄糖诱导的Ca2+依赖性ATP增加，加速2型糖尿病的病理过程[26]。

5结束语

自一百多年以前描述线粒体作为生物细胞的多功能的基本细胞器以来，已知线粒体在能量代谢、信号转导、离子运输，以及维持细胞内环境平衡起到了不可替代的作用。现由于MICU1、MICU2、 MCUR1和EMRE等MCU复合体调控蛋白分子的发现，为进一步研究线粒体的结构和功能特性铺平了道路。我们都知道，线粒体Ca2+信号的分子研究才刚刚开始，我们在研究Ca2+单向转运体的同时考虑到其与其它作用因子之间的关系是很重要的，这些因子包括MICU1、MICU2、 MCUR1和EMRE，还有本文没有讨论到的Letm1[27]、UCPs[28]、TRPC3[29]和NCLX[ 30 ]等因子，对这些因子的研究为我们研究线粒体Ca2+摄取提供了新的认识，更重要的是为研究线粒体钙离子平衡对维持多种细胞的生理功能和诱导致病的病理机制提供了更高的平台。

[参考文献]

[1]Baughman JM, Perocchi F, Girgis HS, et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter[J]. Nature, 2011, 476(7360):341-345.

[2]Martell JD, Deerinck TJ, Sancak Y, et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy[J]. Nat Biotechnol, 2012, 30(11):1143-1148.

[3]Raffaello A, De Stefani D, Sabbadin D, et al. The mitochondrial calcium uniporter is a multimer that can include a dominant-negative pore-forming subunit[J]. EMBO J, 2013, 32(17):2362-2376.

[4]De Stefani D, Raffaello A, Teardo E, et al. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter[J]. Nature, 2011, 476(7360):336-340.

[5]Patron M, Raffaello A, Granatiero V, et al. The mitochondrial calcium uniporter (MCU): molecular identity and physiological roles[J]. J Biol Chem, 2013, 288(15):10750-10758.

[6]Li H, Wang X, Zhang N, et al. Imaging of mitochondrial Ca2+dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: mitochondrial Ca2+uptake and cytosolic Ca2+availability via the endoplasmic reticulum store[J]. Cell Calcium, 2014, 56(6):457-466.

[7]van Vliet AR, Verfaillie T, Agostinis P. New functions of mitochondria associated membranes in cellular signaling[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1843(10):2253-2262.

[8]Chaudhuri D, Sancak Y, Mootha VK, et al.MCUencodes the pore conducting mitochondrial calcium currents[J]. Elife, 2013, 2:e00704.

[9]Hajnóczky G, Booth D, Csordás G, et al. Reliance of ER-mitochondrial calcium signaling on mitochondrial EF-hand Ca2+binding proteins: Miros, MICUs, LETM1 and solute carriers[J]. Curr Opin Cell Biol, 2014, 29:133-141.

[10]Kamer KJ, Mootha VK. MICU1 and MICU2 play nonredundant roles in the regulation of the mitochondrial calcium uniporter[J]. EMBO Rep, 2014, 15(3):299-307.

[11]Csordas G, Golenar T, Seifert EL, et al. MICU1 controls both the threshold and cooperative activation of the mitochondrial Ca2+uniporter[J]. Cell Metab, 2013, 17(6):976-987.

[12]Perocchi F, Gohil VM, Girgis HS, et al. MICU1 encodes a mitochondrial EF hand protein required for Ca2+uptake[J]. Nature, 2010, 467(7313):291-296.

[13]Mallilankaraman K, Doonan P, Cardenas C, et al. MICU1 is an essential gatekeeper for MCU-mediated mitochondrial Ca2+uptake that regulates cell survival[J]. Cell, 2012, 151(3): 630-644.

[14]Plovanich M, Bogorad RL, Sancak Y, et al. MICU2, a paralog of MICU1, resides within the mitochondrial uniporter complex to regulate calcium handling[J]. PLoS One, 2013, 8(2):e55785.

[15]Zhang K, Li Z, Jaiswal M, et al. The C8ORF38 homologue Sicily is a cytosolic chaperone for a mitochondrial complex I subunit[J]. J Cell Biol, 2013, 200(6):807-820.

[16]Rhee HW, Zou P, Udeshi ND, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging[J]. Science, 2013, 339(6125):1328-1331.

[17]Foskett JK, Philipson B. The mitochondrial Ca2+uniporter complex[J]. J Mol Cell Cardiol, 2015, 78:3-8.

[18]Sancak Y, Markhard AL, Kitami T, et al. EMRE is an essential component of the mitochondrial calcium uniporter complex[J]. Science, 2013, 342(6164):1379-1382.

[19]Pagliarini DJ, Calvo SE, Chang B, et al. A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology[J]. Cell, 2008, 134(1):112-123.

[20]De Marchi E, Bonora M, Giorgi C, et al. The mitochondrial permeability transition pore is a dispensable element for mitochondrial calcium efflux[J]. Cell Calcium, 2014, 56(1):1-13.

[21]Giorgi C, Bonora M, Sorrentino G, et al. p53 at the endoplasmic reticulum regulates apoptosis in a Ca2+-dependent manner[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(6):1779-1784.

[22]Marchi S, Lupini L, Patergnani S, et al. Downregulation of the mitochondrial calcium uniporter by cancer-related miR-25[J]. Curr Biol, 2013, 23(1):58-63.

[23]Santulli G, Xie W, Reiken SR, et al. Mitochondrial calcium overload is a key determinant in heart failure[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(36):11389-11394.

[24]Bell JR, Erickson JR, Delbridge LM. Ca2+/calmodulin dependent kinase II: a critical mediator in determining reperfusion outcomes in the heart[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2014, 41(11):940-946.

[25]Quan X, Nguyen TT, Choi SK, et al. Essential role of mitochondrial Ca2+uniporter in the generation of mitochondrial pH gradient and metabolism-secretion coupling in insulin-releasing cells[J]. J Biol Chem, 2015, 290(7):4086-4096.

[26]Tarasov AI, Semplici F, Li D, et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca2+accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic beta cells[J]. Pflugers Arch, 2013, 465(4):543-554.

[27]Jiang D, Zhao L, Clish CB, et al. Letm1, the mitochondrial Ca2+/H+antiporter, is essential for normal glucose metabolism and alters brain function in Wolf-Hirschhorn syndrome[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(24):E2249-E2254.

[28]Trenker M, Malli R, Fertschai I, et al. Uncoupling proteins 2 and 3 are fundamental for mitochondrial Ca2+uniport[J]. Nat Cell Biol, 2007, 9(4): 445-452.

[29]Feng S, Li H, Tai Y, et al. Canonical transient receptor potential 3 channels regulate mitochondrial calcium uptake[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(27):11011-11016.

[30]De Marchi U, Santo-Domingo J, Castelbou C, et al. NCLX protein, but not LETM1, mediates mitochondrial Ca2+extrusion, thereby limiting Ca2+-induced NAD(P)H production and modulating matrix redox state[J]. J Biol Chem, 2014, 289(29):20377-20385.

(责任编辑： 林白霜， 罗森)

线粒体钙单向转运体及其蛋白相互作用的调控*

徐斌，李泱△

(解放军总医院心血管内科，北京 100853)

Mitochondrial calcium uniporter complex and regulation of their protein interactionXU Bin, LI Yang

(DepartmentofCardiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China.E-mail:liyangbsh@163.com)

[ABSTRACT]Mitochondrial calcium homeostasis plays a key role in maintaining various cellular characteristics and mediating cellular physiological function and pathological processes. Although it has long been known that mitochondria takes up Ca2+, the molecular identities of the channels and transporters involved in this process are revealed only recently. Here, we review the structure and function of the channel-forming subunit, mitochondrial calcium uniporter (MCU) and its regulators, which include MICU1, MICU2, and MCUR1.

[关键词]线粒体； 钙单向转运体； 钙平衡

[KEY WORDS]Mitochondria; Calcium uniporter; Calcium balance

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.031

[中图分类号]R363

[文献标志码]A