角膜活体共聚焦显微镜在青光眼临床研究中的应用

龚岚　林通



·青光眼专题·

角膜活体共聚焦显微镜在青光眼临床研究中的应用

龚岚林通

角膜活体共聚焦显微镜作为一种非侵入性、高分辨率的眼表成像仪器，可以对角膜、结膜、睑板腺等眼表组织进行细胞水平的微观形态检测。青光眼患者的眼表健康逐渐受到关注，越来越多的研究针对抗青光眼药物和手术治疗对患者眼表组织结构的影响进行探究。近年来国内外许多学者已将角膜活体共聚焦显微镜从眼表疾病的应用引入青光眼临床问题的探究中。因此，本文就角膜活体共聚焦显微镜在青光眼临床研究中的应用现状进行阐述，为今后研究开拓新思路。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：166-169)

青光眼；显微镜，共焦；眼表

角膜活体共聚焦显微镜(invivoconfocal micro-scopy，IVCM) 是一种具有高分辨率的新型非侵入性眼表成像仪器，利用其共焦切片功能，在活体下即可多层次地观察眼表组织中的有形成分，并且还可以实时地拍摄细胞水平的组织形态与变化。正因其具有无创、微观及活体下观察组织结构的优势，自1990年首次报道了活体下IVCM拍摄的人类角膜分层图像以来，其在眼表结构观察及临床研究中的应用得到不断的拓展。目前， IVCM对角膜上皮、角膜基质细胞、角膜神经、角膜内皮细胞、结膜上皮、杯状细胞以及睑板腺等眼表组织结构均可以进行形态观察。在近二十余年的应用历史中，IVCM在眼表研究及临床应用中均取得了较大的进展，包括感染性角膜病诊断的鉴别；角膜变性、营养不良、圆锥角膜等病理状态下角膜组织的细胞形态学观察；屈光手术及角膜移植术后角膜神经及组织愈合情况的观察；干眼症和角、结膜烧伤的眼表状态观察；配戴角膜接触镜的眼表状态观察；眼表疾病中免疫呈递细胞的动态观察等。由此看来，角膜IVCM已成为眼表临床工作及研究中的得力助手。近年来，随着青光眼患者的眼表健康日益受到关注，国内、外学者逐渐将IVCM应用于青光眼的临床研究中。本文就角膜IVCM在青光眼临床研究中的应用现状进行阐述，进而为青光眼患者眼表问题的探究开拓新的研究思路。

1　青光眼的结膜ICVM结构及形态改变

1.1结膜滤过泡的观察最早将IVCM应用于青光眼的研究，主要是利用其观察滤过性抗青光眼手术后结膜滤过泡的结构和功能。2004年，Labbé等[1]首次报道了利用IVCM活体观察抗青光眼术后有功能性和无功能性结膜滤过泡组织结构的差异，发现有功能性的滤过泡中结膜微囊数量明显多于无功能性的滤过泡，并且前者滤过泡上皮下结缔组织较后者疏松，更利于房水的引流。此后也有学者[2]证实，IVCM检测的结膜滤过泡相关参数包括结膜上皮微囊密度、微囊面积、微囊封闭情况均与滤过泡的功能间存在确切的相关性。由此看出，IVCM可用于区分有功能性和无功能性滤过泡，这对于临床中客观评价抗青光眼术后疗效有重要的提示作用。相比于裂隙灯下观察滤过泡形态，IVCM检测可以了解到更为细微的变化和结构特点。正因为如此，此后更多的研究采用IVCM检测滤过泡的微观结构，作为一种客观的形态学检测方法用于评价抗青光眼术后的疗效情况[3-4]。也有研究[5]利用其观察滤过性抗青光眼手术采用不同制瓣方式时结膜滤过泡的结构、形态和功能的差异，进而评价不同制瓣方式对滤过性抗青光眼手术的影响。但IVCM对抗青光眼手术后结膜滤过泡的功能性是否具有早期的预判作用，尚需要进一步的探究论证。

1.2结膜上皮微囊的改变结膜上皮微囊的改变早期在滤过性手术后结膜滤过泡中被IVCM检测到的。它是一种类圆形或椭圆形的结膜上皮细胞外囊性结构，在滤过泡内的结膜上皮微囊一般直径为10～200 μm。在未行滤过性手术的青光眼患者中也可以观察到结膜上皮微囊的改变，但其尺寸要小于滤过性手术后的结膜上皮微囊，直径通常为10～90 μm。有学者[6]观察了未行过手术治疗的正常眼压性青光眼和原发性开角型青光眼患者结膜的IVCM形态，发现2种类型的青光眼患者结膜均存在明显的上皮微囊改变，结膜上皮微囊密度相比于正常人群高出4～5倍。但这2种类型青光眼之间并没有差异。青光眼患者在行小梁滤过手术之前就已经存在上皮微囊改变这一结论在多项研究中都得到证实[7-8]。青光眼患者的这种结膜上皮微囊改变，目前认为主要是房角-小梁网-房水排出途径由于各种原因受阻，进而经葡萄膜-巩膜房水排出途径代偿性增强引起。在滤过性抗青光眼手术之后，结膜的上皮微囊改变更加明显，特别是在滤过泡区域内，其结膜微囊密度和面积都有明显增加[7]。通过IVCM检测结膜微囊密度和面积，除了应用于评价小梁切除术滤过泡的结构和功能外，也有研究将其应用于无滤过泡的(非滤过泡依赖的)滤过性手术后结膜形态的观察。有学者[9]将IVCM应用于前房-脉络膜上腔分流装置Gold Micro-Shunt植入术效果的观察中，发现手术疗效佳的患者其结膜微囊的密度和面积明显大于手术疗效差的患者。此外，还有学者[10]将其应用于评价Schlemms管成形术后结膜的形态、结构改变，发现成功的Schlemms管成形术后12周可见其球结膜的上皮微囊密度和面积较术前有明显增大；而疗效差的患者术后与术前相比没有明显的差异。由此看出各类青光眼手术后结膜上皮微囊的改变往往提示术后经巩膜、结膜引流途径的增强。因此，通过IVCM评价结膜微囊密度和面积可以用于判别这类手术结构层面上的成败。

1.3长期使用抗青光眼药物引起的结膜改变有大量的证据已经证实，抗青光眼药物中的防腐剂在患者的眼表损伤中起到重要作用，因此不含防腐剂的抗青光眼制剂应运而生。有研究[11]将IVCM应用于观察青光眼药物对患者结膜结构的影响，发现长期使用含防腐剂的β-受体阻滞剂可造成结膜杯状细胞密度和结膜上皮细胞的规则性明显下降，而不含防腐剂的β-受体阻滞剂对结膜结构的影响并不明显。利用IVCM前瞻性的研究发现，对于从未用过药的原发性开角型青光眼患者分为2组进行治疗，一组给予含防腐剂的抗青光眼药物，另一组给予不含防腐剂的抗青光眼药物，用药6个月后IVCM检测发现的结膜杯状细胞密度在含防腐剂组下降较不含防腐剂组明显[12]。这几项研究提示，对于需要长期使用抗青光眼药物的患者，如果本身眼表比较脆弱的情况下，选择不含防腐剂的抗青光眼药物对于患者眼表健康的维持具有重要意义。此外，由本院青光眼专业组和眼表专业组联合开展的研究[13]，采用IVCM观察了目前临床常用的几类抗青光眼药物长期使用对于结膜结构的影响，结果发现，β-受体阻滞剂、α-肾上腺素受体激动剂、前列腺素类抗青光眼药物及这几类药物的联合使用对结膜组织均有一定程度的影响，包括杯状细胞密度的下降、树突细胞的浸润增加以及上皮下纤维化；并且通过比较发现，前列腺素类药物对结膜组织的影响相对小于其他2种抗青光眼药物。这对于临床用药的选择也有一定的指导意义。

2　青光眼的角膜IVCM结构及形态改变

青光眼患者由于长期用药引起角膜病变这一问题日益受到关注。近年来随着认识的不断深入，青光眼医师对于患者的治疗不仅仅局限在控制眼压，同时也注重患者的眼表健康。由于IVCM对角膜各层组织结构均可以清晰成像，利用其可以观察抗青光眼药物对患者角膜上皮、基底膜下神经、基质层、角膜内皮细胞及角膜缘组织的影响。通过IVCM检测，有研究[14]发现，长期使用含防腐剂的抗青光眼药物引起角膜上皮细胞密度降低；而不含防腐剂的抗青光眼药物对于角膜上皮细胞密度影响不大。因此认为，青光眼患者角膜上皮细胞受损主要与防腐剂的毒性作用有关。此外，研究[14-15]还发现，长期使用抗青光眼药物的患者基底膜上皮细胞相比于正常人群密度增加。分析认为是由于抗青光眼药物对角膜上皮细胞的损伤刺激基底上皮细胞代偿性增殖引起。角膜上皮基底膜下神经也受到抗青光眼药物的影响。多项研究[14，16-17]中IVCM检测发现，长期使用抗青光眼药物能够引起角膜上皮基底膜下神经纤维密度降低，特别是含有防腐剂的抗青光眼药物对于角膜上皮基底膜下神经的损伤更为明显[14]。此外Bergonzi等[18]发现，长期使用前列腺素类抗青光眼药物使得角膜基质细胞密度增加，同时角膜基质层细胞外基质减少，分析认为与金属蛋白酶激活有关。由此作者推测，长期使用前列腺素类抗青光眼药物在一定程度上可能会影响角膜厚度，但尚需进一步研究论证。Ranno 等[19]通过IVCM检测发现，用药2年以上的青光眼患者角膜内皮细胞密度明显小于未使用过抗青光眼药物的患者，但不同抗青光眼药物(β-受体阻滞剂和前列腺素类药物)之间并没有明显差异。

IVCM也可以用于角膜缘结构的成像，有学者利用IVCM观察抗青光眼药物对角膜缘结构的影响，结果发现长期使用青光眼药物可以引起患者角膜缘移行细胞的不规则改变和树突细胞浸润增多。相比于不含防腐剂的药物，这种改变在含防腐剂的青光眼药物中更为明显，并且随着使用药物种类的增多，其角膜缘的异常改变更明显[20]。早在2001年已有学者[21]提出，由于长期使用抗青光眼药物引起医源性角膜缘干细胞缺乏。现在利用IVCM观察角膜缘的细微结构，能够提供确切的病理依据，进一步论证了这一事实。

3　青光眼的睑板腺IVCM结构及形态改变

抗青光眼药物对于睑板腺结构和功能的影响近年来也受到关注。自2011年陆续有多位学者观察了长期使用抗青光眼药物后睑板腺结构和功能的改变[22-24]。其中一项研究通过患眼和健侧眼的自身对照，发现患眼[使用前列腺素类药物或β-受体阻滞剂，周期约(7.9±6.0)年]的睑板腺缺失及睑脂的性状评分均明显差于健侧眼(未使用抗青光眼药物)[24]。但是对于抗青光眼药物引起睑板腺结构和功能改变机制的研究尚较为缺乏。2013年，Agnifili 等[25]通过IVCM对长期使用抗青光眼药物患者的睑板腺进行了观察，发现这些患者的睑板腺腺泡密度和腺泡单位面积减少，腺泡脂质反射信号增强，导管开口扩张，腺泡壁及腺泡间隙反射信号增强(炎症征象)。这些改变与阻塞型睑板腺功能障碍患者的IVCM检测各参数有部分相符合，但腺泡单位面积减少在阻塞型睑板腺功能障碍患者中并没有发现。该研究同时发现，使用含防腐剂的前列腺素类药物患者，其睑板腺腺泡壁及腺泡间隙炎症反应明显强于不含防腐剂的前列腺素类药物，但在使用含防腐剂或不含防腐剂的β-受体阻滞剂的患者之间并没有发现差异性。因此认为，相比于β-受体阻滞剂，前列腺素类药物更易引起睑板腺腺泡炎症反应。从这项研究可以看出，利用IVCM能够更为深入地揭示抗青光眼药物引起睑板腺结构、功能改变的微观机制。

4　IVCM应用于青光眼临床研究的局限性

目前IVCM只能对组织结构中的有形成分及细胞进行形态学的观察，无法明确相应组织结构及细胞的表型。组织中的细胞及相应结构尚需要经验较为丰富的检测者进行区分。当然随着应用经验和大量研究证据的积累，对于大多数的眼表组织结构及细胞都能明确其性状。但对于某些细胞及组织的鉴别仍然存在不确定性，例如利用IVCM观察到的杯状细胞容易与炎症引起的上皮细胞鳞状化生混淆。目前尚无法明确结膜上皮微囊改变就是由于房水经巩膜途径渗透至结膜引起的改变，也可能是由于结膜上皮细胞退行性病变引起。此外，IVCM检测到的树突细胞单纯从形态上进行判别是否准确？这些问题仍需商榷。有些眼表结构由于解剖因素尚无法被IVCM观察到，例如泪腺、结膜深部的巩膜结构等。因此今后IVCM仍需要加强其穿透的深度及对组织结构观察的分辨率。

对于眼表组织的观察和研究以往以组织病理、免疫组织化学、印迹细胞学等手段为主；IVCM的出现，部分替代了以往的病理检查手段，这一无创、微观及活体下观察方法也给青光眼的临床研究开辟了新的领域。IVCM有助于抗青光眼手术后滤过泡结构和功能的判别，同时有助于客观检测抗青光眼药物对眼表组织结构的影响和损害，为青光眼的临床药物选择提供参考依据。此外，术前通过IVCM检测明确患者的结膜组织条件是否存在不利于滤过泡功能维持的因素，这为抗青光眼手术术式的选取提供了一定的参考价值。当然IVCM在青光眼临床研究中是否还会有新的应用，仍需要眼科研究者进一步的拓展和探索。

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(本文编辑诸静英)

Application of in vivo laser scanning confocal microscopy in clinical research of glaucoma

GONG Lan, LIN Tong.

Department of Ophthalmology, Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University; Key Laboratory of Myopia, Ministry of Health, Shanghai 200031 China Corresponding author： GONG Lan, Email: 13501798683@139.com

Cornealinvivolaser scanning confocal microscopy (IVCM), as a noninvasive measurement, provides micro-structural information of the anterior segment tissues of the eye and allows high-resolution imaging of the cornea, conjunctiva and meibomian glands at the cellular level. Health of ocular surface in glaucoma patients has been gradually concerned. Previous studies have been conducted to investigate the influence of anti-glaucoma drugs and surgeries on the structure of ocular surface in glaucoma patients. In past years, the application of IVCM has progressively extended to clinical research for glaucoma patients. Thus this paper reviewed the studies of IVCM observation for glaucoma and provided a new research approach to interpret the mechanism of ocular surface alterations in glaucoma.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16: 166-169)

Glaucoma; Microscopy，confocal; Ocular surface

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 卫生部近视眼重点实验室上海200031

龚岚(Email:13501798683@139.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.03.005

2016-03-13)