高效液相色谱法同时测定霉酚酸酯及霉酚酸的血药浓度

高效液相色谱法同时测定霉酚酸酯及霉酚酸的血药浓度

朱顺海1*赵梦芸2陈佳2许志良1**

（1.浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053；2.中科（杭州）生命科学院有限公司 杭州 310052)

摘 要目的：建立高效液相色谱法同时测定人体血浆中霉酚酸酯及霉酚酸的药物浓度。方法：血浆样品经乙腈沉淀蛋白后直接进样，采用Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）的色谱柱，流动相为0.3%的三乙胺水溶液（用磷酸调节pH 5.3）-乙腈（50∶50）。检测波长为215 nm，柱温 35 ℃，流速 1.0 ml/min。结果：本方法测定的线性范围为0.25 ~20 mg/ml，r(霉酚酸)=0.999 76，r(霉酚酸酯)=0.999 99。霉酚酸和霉酚酸酯的加标回收率分别为（87.38±2.97）%和（99.71±1.18）%，最低检出限分别为0.035 mg/ml和0.070 mg/ml（S/N=3）。结论：本方法简单，灵敏，重现性好，适合器官移植等患者霉酚酸及霉酚酸酯的血药浓度监测，以及霉酚酸酯的药代动力学研究。

关键词霉酚酸酯 霉酚酸 血药浓度 高效液相色谱法 药代动力学

Simultaneous determination of the concentration of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid in plasma by HPLC

ZHU Shunhai1*, XU Zhiliang1, ZHAO Mengyun2, CHEN Jia2**

(1.Basic Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2. Zhongke (Hangzhou) Life Sciences Co. Ltd., Hangzhou 310052, China)

ABSTRACTObjective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of the concentrations of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid in human plasma. Methods: The plasma sample was analyzed by HPLC on a Zorbax SB-C18column (4.6 mm×250 mm，5 mm) with 0.3% aqueous triethylamine - acetonitrile (50:50) as a mobile phase at the detection wavelength of 215 nm, column temperature of 35 ℃ and flow velocity of 1.0 ml/min after the proteins were precipitated out by acetonitrile. Results: The standard curve was linear over the range of 0.25 ~10 mg/ml with r(MPA)=0.999 76, r(MMF)=0.999 99. The recoveries of MPA and MMF were （87.38±2.97）% and（99.71±1.18）% and the limit of detection for MPA and MMF were 0.035 mg/ml and 0.070 mg/ml（S/N=3）. Conclusion: This method is simple, sensitive, reproducible, and suitable for the monitoring of the concentrations of mycophenolic acid and mycophenolate mofetil in patients with organ transplantation and the pharmacokinetic study of mycophenolate mofetil.

KEY WORDSmycophenolate mofetil; mycophenolic acid; blood concentration; HPLC; pharmacokinetics

霉酚酸酯(又称麦考酚酸酯，mycophenolate mofetil，MMF)，商品名为骁悉（Cellcept），是霉酚酸(Mycophenolic acid， MPA)的吗啉代乙酯。1995年5月霉酚酸酯获得美国食品药品管理局(FDA)认可，用于预防肾移植急性排斥反应，并在以后的应用中取得了较好效果。1998年10月该药成为美国正式批准上市的具有免疫抑制作用的药物[1]。作为免疫抑制剂，霉酚酸酯已广泛应用于预防肾脏等实体器官移植的急性排斥反应[2]。MMF在体内代谢为活性代谢物MPA而发挥作用，MPA主要通过非竞争性、可逆性抑制嘌呤从头合成途径的限速酶次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶（IMPDH），强烈抑制T、B淋巴细胞增殖而发挥免疫抑制作用[3-4]。国内临床上应用常规剂量（1～2 g/d）获得理想效果，但由于MMF的个体间差异普遍存在，所以常规剂量可能会带来个体间疗效差异和不良反应的出现。可通过监测MMF和MPA的血药浓度，制定个体化给药方案，达到最佳疗效

及最低不良反应。目前针对MPA的血药浓度含量检测也比较多见，国内外报道的主要有高效液相色谱法（HPLC）和酶放大免疫分析技术（EMIT）两种方法。EMIT特异性不如HPLC，因为葡萄糖苷酸代谢产物AcMPAG与MPA有交叉反应， 因此， EMIT法测出的MPA浓度偏高，而HPLC 可单独测MPA 浓度，不受AcMPAG的影响[5]。所以目前用的最多的是HPLC法[6-9]，但是同时对MMF 和MPA进行血药浓度测定不多。本文旨在建立HPLC法同时测定血浆中霉酚酸酯和霉酚酸的血药浓度，其操作简单，分析速度快，有望适于临床上开展MMF和MPA的血药浓度监测，实现患者个体化给药的目标。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，配紫外可见波长检测器（安捷伦科技有限公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司），德国IKAVortex 3涡旋混合器（广州意测仪器有限公司），贝克曼Allegra 64 R高速冷冻台式离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.2 试剂

霉酚酸酯及霉酚酸对照品（Sigma，含量：≥98%，上海纯优生物科技有限公司）；甲醇和乙腈均为色谱纯（南京荣华科学器材有限公司）；三乙胺（杭州萧山创益化工仪器有限公司）与磷酸（杭州永星五交化有限公司）均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 mm），流动相：0.3%的三乙胺水溶液（用磷酸调节pH至5.3）-乙腈（50∶50），流速：1.0 ml/min，柱温：35 ℃，检测波长：215 nm，进样量10 ml。

2.2 标准溶液配制

2.2.1 标准储备液

分别精密称取霉酚酸及霉酚酸酯对照品10.0 mg于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定量至刻度，使它们质量浓度都为1.00 mg/ml的标准储备液，4 ℃冷藏保存。

2.2.2 标准工作液

分别精确吸取200 ml的霉酚酸和霉酚酸酯标准储备液，置于10 ml的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使之浓度为20.00 mg/ml的混合标准溶液。继而用甲醇稀释成浓度分别为0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00及20.00 mg/ml的混合标准工作液。分别进样10 ml，并记录色谱图，绘制标准曲线。

2.3 线性范围

在“2.1”色谱条件下，将“2.2.2”配制的标准工作液分别从低浓度到高浓度进样，以所得峰面积对相对应的标准工作液浓度（mg/ml）作标准曲线。实验测得霉酚酸和霉酚酸酯在0.25 ~20.00 mg/ml的浓度范围内，其线性回归方程分别为C=88.102 36A-8.368 51 （r=0.999 76）；C=58.397 29A+5.319 83（r=0.999 99）。表明其线性均良好。

2.4 样品处理

取200 ml血浆样品于1.5 ml Eppendorf管中，加乙腈800 ml，涡旋振荡2 min，15 000 r/ min离心10 min，取上清液10 ml进样分析。记录色谱图，从标准曲线上查得霉酚酸及霉酚酸酯的浓度。

2.5 色谱图

在2.1项色谱条件下，霉酚酸和霉酚酸酯分别在4.5 min和8.5 min左右出峰，血浆中其他杂质基本在4 min内洗脱下来。对照品、空白血浆样品和加标血浆样品以及患者口服1.0 g骁悉胶囊0.5 h后的血浆样品色谱峰见图1。

2.6 精密度实验

为了考察方法的精密度，精密吸取对照品储备液适量，分别用空白血浆稀释配制成含MPA和MMF 0.25、10.00及20.00 mg/ml血浆溶液，按2.4项方法处理，在2.1项色谱条件下，获得色谱图，外标法读取MPA和MMF的浓度。在同一天内和不同天内（n=5）分别考察方法的精密度和重复性。结果显示均符合体内血药浓度分析要求（RSD%≤10%，表1）。

图1 霉酚酸和霉酚酸酯的色谱图

表1 MPA、MMF血药浓度测定的精密度（n=5）

2.7 回收率实验

按2.6项同法操作，测定加标回收率（每个浓度平行测得5次），以考察方法的准确度。以测得的量与加入量之比作为回收率的值。结果见表2。

表2 MPA、MMF血药浓度测定的回收率（n=5）

2.8 方法检出限

选取空白血清，添加MPA、MMF混和标准溶液，使得添加浓度依次为0.025、0.035、0.050、0.070 和0.10 mg/ml，按2.6项同法操作，以考察方法检出限。我们以S/N=3计，得到霉酚酸和霉酚酸酯在本方法中的检出限分别为0.035 mg/ml和0.070 mg/ml。

2.9 稳定性实验

精密吸取混合标准溶液适量，用空白血浆稀释成浓度为5.0 mg/ml的模拟血浆样品4份，均在室温保存，分别于0、2、24和48 h按2.4项下方法处理样品，在2.1项色谱条件下进样分析。计算每个时间点的回收率（表3）。参照2010版药典规定，如相对回收率在80%～120%范围内，即认为样品没有明显差异。结果显示室温对MPA及MMF血药浓度没有明显影响，在48 h内稳定。

表3 血样在室温下放置不同时间对MPA、MMF的回收率影响

2.10 血样数据

肾脏移植患者口服1.0 g骁悉胶囊后，分别于0、0.5、1、2和6 h采集血样，分离出血浆，HPLC分析结果显示他们血浆内的MMF浓度均为0，可见MMF体内吸收迅速（表4）。

表4 肾脏移植患者口服MMF后MPA的血药浓度（mg/ml）监测

3 讨论

pH对MMF和MPA峰型影响很大，可能是由于酚

羟基及羧基与色谱柱的硅醇基结合较紧密，导致峰型不好和拖尾现象，因此合理的pH至关重要。我们经过多次实验发现当0.3%的三乙胺水溶液的pH用磷酸调到5.3左右时，峰型较对称。乙腈-0.3%的三乙胺水溶液为50∶50时，MPA和MMF可以很好地分离，且不受内源性药物的影响。

本方法采用乙腈沉淀蛋白方法处理血浆样品，快速、简单，MMF和MPA在10 min之前均能出峰且回收率和重现性好，非常适合临床上患者服用MMF后的血药浓度监测及药物代谢动力学研究。

口服霉酚酸酯后，体内迅速吸收，在血浆酯酶作用下变成具有生物活性的霉酚酸。本文研究表明肾脏移植患者口服霉酚酸酯胶囊（1.0 g）0.5 h后几乎检测不到MMF，但这并不意味着检测MMF的血药浓度毫无意义。因为，一方面，检不出MMF的含量就说明了患者体内有足够或相当量活性的血浆酯酶；另一方面，血浆酯酶存在个体差异，在血浆酯酶活性极低的患者，可能能够检出MMF[9]，对这类患者，同时检测MMF和MPA的血药浓度有重要的临床意义。

有文献研究报道，MMF 的个体间药代动力学差异较大， 在器官移植两周后，服用1 g剂量的霉酚酸酯胶囊，不同患者间Co最大可相差21.4倍（0.32～6.86 mg/L），AUC 0-12 h最大可相差9.3倍（10.60～98.73 mg/L）[10]，即使同一个患者，在移植后数周内的MPAAUC可升高30%~50%[11]。主要是可能受到移植肾功能、并发症和联合用药等众多因素的影响，造成患者服用同样剂量，但不良反应却有显著差异。因此，监测MMF 和MPA的血药浓度，有助于了解个体MMF的药代动力学，有望实现个性化给药。

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收稿日期：（2014-11-11）

通讯作者：**许志良（1966-），男，副教授，硕士生导师，从事系统生物学的现代化研究。E-mail: xzl8811@163.com

作者简介：*朱顺海（1988-），男，硕士研究生。E-mail: zsh261908@126.com

文章编号：1006-1533(2015)07-0077-04

文献标识码：A

中图分类号：O657.72; R979.5