HPLC法测定霉酚酸有关物质及流动相pH值的确定

张红飞，林进南，连子龙，翁杨微，杨斌

（1.福建和泉生物科技有限公司，福建 建阳 354200；2.福建省建阳武夷味精有限公司，福建 建阳 354200）

HPLC法测定霉酚酸有关物质及流动相pH值的确定

张红飞1，林进南1，连子龙1，翁杨微1，杨斌2

（1.福建和泉生物科技有限公司，福建 建阳 354200；2.福建省建阳武夷味精有限公司，福建 建阳 354200）

为确定HPLC法测定霉酚酸有关物质所用流动相的合理pH值，配制pH值为4.5和5.5的流动相，采用Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5μm×100A）对霉酚酸进行有关物质的测定，对于同一个样品连续进样6次，按照面积归一化法进行计算，以霉酚酸百分含量的相对标准偏差（RSD%）来确定流动相的合理pH值。结果显示采用pH值为4.5的流动相进行霉酚酸有关物质的HPLC测定，其测定结果稳定性好、灵敏度高、重现性好，可用于霉酚酸有关物质的测定。

HPLC；霉酚酸；有关物质；流动相pH值

霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）是次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶（IMPDH）的抑制剂，能够抑制鸟嘌呤核苷酸的合成途径［1］。其酯类衍生物霉酚酸酯（mycophenolatemofetil，MMF）被人体服用后会被血浆酯酶水解为具有活性的霉酚酸［2］，大大提高了霉酚酸的利用程度。

国内已有较多采用HPLC对血浆中霉酚酸浓度和相关代谢产物的检测方法［2-4］，关于霉酚酸原料有关物质的检测，也有文献进行了专门报道［1，5-6］。关于霉酚酸原料有关物质的检测，文献中使用的色谱柱大部分为C8色谱柱，且流动相的pH值调节均为混合前，而对于混合后的流动相最终pH值未见报道。本文在建立原料药霉酚酸有关物质的检测方法时，使用的是C18色谱柱，最初也采取流动相混合前调节pH值的方法，但在稳定性考察中发现霉酚酸有关物质中的最大单一杂质峰极不稳定。我们之后采取流动相先混合再调节pH值的方法，使用同样的色谱条件，连续进样6次，霉酚酸有关物质中的最大单一杂质峰稳定。本文采用流动相混合后再调节pH值的方法对霉酚酸进行有关物质的检测，建立了霉酚酸有关物质的HPLC测定方法，可同时测定总杂质和最大单杂，为霉酚酸原料的质量控制建立标准。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

高效液相色谱仪：Agilent 1260，包括四元梯度泵、自动进样器、原装柱温箱、紫外检测器、Agilent Chem Station化学工作站；XS105DU梅特勒分析天平（感量0.01mg）。

1.1.2 样品与试剂

霉酚酸样品由本公司提供（批号：1405003、1405004、1405005）；乙腈为色谱纯（默克公司）；乙酸铵、冰乙酸均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

流动相：0.01 mol/L乙酸铵溶液-乙腈（V（乙酸铵溶液）∶V（乙腈）=45∶55），混合后使用冰乙酸调节pH值为4.5；进样量：20μL；检测波长：249 nm；柱温：25°C；流速：1.0mL/min。色谱柱采用瑞典EKA Chemicals公司原装Kromasil高效液相色谱柱（4.6 mm×200 mm，5μm×100A，C18)。

1.2.2 供试品溶液的制备

称取供试品约20mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，用流动相溶解后定容至刻度，制成每1 mL中约含0.4mg供试品的溶液。

1.3 流动相pH值对供试品稳定性影响实验

为了分析流动相的pH值对供试品稳定性的影响，在试验的过程中，我们按照上述色谱条件及配制的供试品溶液进行测定，仅改变溶解供试品用流动相和分析过程使用流动相的pH值，每一种方案平行进样6次。

2 结果与讨论

2.1 霉酚酸的色谱图

用本色谱系统检测霉酚酸有关物质，色谱图如图1所示。各杂质峰均能与霉酚酸主峰达到良好的分离。试验表明配制后的供试品溶液在12 h内稳定，可用于霉酚酸有关物质的检测。

图1 试验色谱图

2.2 流动相pH值对供试品稳定性影响

根据1.3中的实验设计方案，每一种方案平行进样6次，测得的具体结果见表2。

表2 流动相pH值对供试品稳定性影响实验结果

通过表2数据可以得出如下结论：流动相的pH值仅对其杂质峰的稳定性有影响，对于霉酚酸主峰的稳定性没有影响。所以我们最终确定所用流动相的pH值为4.5。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性试验

称取霉酚酸适量，用流动相制成浓度为1 620 μg/mL的溶液，分别精密量取溶液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0mL置于10mL的容量瓶内，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，得到浓度分别为810、648、486、324、162μg/mL的溶液。分别进样20μL，记录色谱图。由溶液浓度对霉酚酸色谱峰的峰面积进行线性回归，实验表明，其线性关系良好（R2= 0.9998）。霉酚酸在浓度162～810μg/mL范围内，其线性关系良好。

图2 线性回归图

2.3.2 精密度

取配制好的霉酚酸供试品溶液。按上述色谱条件连续进样6次，以霉酚酸峰面积计算，RSD为0.17%；以有关物质中的最大杂质峰面积计算，RSD为0.68%。

2.3.3 重复性试验

取同一批号的霉酚酸样品适量，平行称取6份，用流动相分别配制成浓度为0.4mg/mL的供试品溶液，摇匀。按上述色谱条件测定，按面积归一化法计算，霉酚酸含量的RSD为0.20%；最大单杂含量分别为0.30%、0.30%、0.29%、0.29%、0.29%、0.29%，RSD%为1.76%。

2.3.4 稳定性试验

取上述2.3.2项下的供试品溶液1份，分别在0、3、6、9、12 h按上述色谱条件进行测定，以霉酚酸峰面积计算，RSD为0.52%；以有关物质中的最大杂质峰面积计算，RSD为0.72%。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定。

3 结论

HPLC法测定霉酚酸有关物质的过程中，供试品溶液的稳定性至关重要，不仅要求霉酚酸主峰的峰面积稳定，各杂质峰的峰面积也要稳定，方能确保使用面积归一化法计算其有关物质含量的准确性。笔者在建立本方法时发现，采用传统的混合前调节流动相pH值的方法，测定过程中最大单杂及总杂极不稳定。关于霉酚酸供试品溶液的稳定性问题，相关文献中也有描述，认为其在氧化、高温及光破坏均不稳定［5］。

本研究在建立霉酚酸有关物质的HPLC测定方法时，通过对比分析溶解供试品用流动相的pH值和分析过程使用流动相的pH值，发现在使用该方法进行霉酚酸有关物质的测定时，流动相的pH值是影响其稳定性的关键因素。通过研究发现，使用混合后pH值为4.5的流动相进行供试品溶液的配制及过程分析，供试品溶液在12 h内稳定，可用于霉酚酸有关物质的测定。

经过方法学验证该方法稳定性强、灵敏度高、重现性好、用于测定的供试品溶液的浓度范围广，适合于霉酚酸原料的有关物质的测定。

［1］刘胜兴，林芹.高效液相色谱法测定霉酚酸含量及有关物质［J］.中外医疗，2010，29(27)：61.

［2］宋洪杰，张黎明，胡晋红，等.高效液相色谱法同时测定人血浆中霉酚酸及其葡糖苷酸［J］.第二军医大学学报，2002，23(4)：400-402.

［3］师少军，李忠芳，万元胜，等.HPLC法测定人血浆中霉酚酸的浓度及药动学研究［J］.中国药房，2007，18(20)：1558-1560.

［4］宋青，张华峰，戴博，等.高效液相色谱法测定人血浆中霉酚酸的浓度［J］.解放军药学学报.2011，27(3)：241-243.

［5］蒋顺进，黄炜乾，凌波.高效液相色谱法测定MPA含量及有关物质［J］.医学信息（中旬刊），2010，05(7)：1948-1949.

［6］韩四忠.HPLC法同时测定霉酚酸及其代谢产物的方法学研究［J］.安徽医药，2013，17(12)：2033-2036.

（责任编辑：朱小惠）

Determ ination ofm ycophenolic acid related substances by HPLC and optim ization of pH ofmobile phrase

ZHANG Hongfei1，LIN Jinnan1，LIAN Zilong1，WENG Yangwei1，YANG Bin2
(1.Fujian Hequan Biotechnology Co.，Ltd.，Jianyang 354200，China；2.Fujian Province JianyangWuyiMSG Co.，Ltd.，Jianyang 354200，China)

Mycophenolic acid related substance was analyzed by HPLC equipped with Kromasil C18chromatogram column(4.6mm×200mm，5μm×100A)and the reasonable pH ofmobile phase was determined.The same sample was analyzed for 6 times and determined according to area normalization method.The optimal pH ofmobile phrase was determined on the basis of relative standard deviation(RSD%)ofmycophenolic acid percentage.Themethod showed good stability，high sensitivity and good reproducibility when the pH value of themobile phrase was 4.5.

HPLC；mycophenolic acid；related substances；pH ofmobile phase

TQ46

A

1674-2214(2015)04-0048-03

2015-06-04

张红飞（1983—），男，河南汤阴人，执业药师，主要从事质量管理工作，E-mail：zhf108@163.com.