吸入氢气对失血性休克大鼠肺组织水通道蛋白表达的影响

吸入氢气对失血性休克大鼠肺组织水通道蛋白表达的影响

卜庆丽1，闫战秋2，李会1，李恩琪2，帅训军1，姜敏1，艾登斌1

(1青岛市市立医院，山东青岛266011；2潍坊医学院)

摘要：目的探讨吸入氢气对失血性休克大鼠肺组织水通道蛋白(AQP)表达的影响。方法选择成年雄性SD大鼠40只，随机分为假手术对照组(CON组)、失血性休克组(SH组)、1%氢气组(1%H2组)及2%氢气组(2%H2组)，每组各10只。SH组、1%H2组及2%H2组制备大鼠失血性休克模型，1%H2组和2%H2组分别在模型制作过程中吸入1%、2%的氢气，其他组操作中不吸入氢气。复苏2 h时，采集各组大鼠动脉血，行血气分析，测算氧合指数(PaO2/FiO2)。处死大鼠取肺组织，测定肺组织肺湿干重比(W/D)。光镜下观察肺组织，进行病理评分。取左肺组织，制成10%组织匀浆，离心后取上清液，采用酶联免疫吸附法测定肺组织AQP-1、AQP-5蛋白。结果SH组、1%H2组、2%H2组W/D、肺组织病理评分均高于CON组，PaO2/FiO2、AQP-1及AQP-5蛋白表达均低于CON组(P均<0.05)。1%H2组及2%H2组W/D、肺组织病理评分均低于SH组，PaO2/FiO2、AQP-1及AQP-5蛋白表达均高于SH组(P均<0.05)。结论 吸入氢气可能通过增加肺组织中AQP-1、AQP-5蛋白的表达，从而减轻失血性休克大鼠肺损伤的程度。

关键词：氢气；失血性休克；急性肺损伤；水通道蛋白

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.009

中图分类号：R605.971 文献标志码：A

收稿日期：(2015-07-10)

通信作者：艾登斌

失血性休克是临床常见的危重症，其中肺是最常受累的器官。肺损伤是导致休克后全身炎症反应的重要病理过程。因此，如何防治失血性休克后的急性肺损伤具有重要的临床意义[1,2]。研究表明，休克后肺损伤与肺内水分子的渗出及清除平衡失调有关。水通道蛋白(AQP)是一种对水分子有通透性的膜蛋白分子，与急性肺损伤、肺水肿密切相关[3]。AQP-1和AQP-5在肺脏组织中高度表达，对维持肺内水平衡起着重要作用[4]。氢气是一种生理惰性气体，可通过抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用治疗急性肺损伤[5]。但氢气对肺组织AQP的作用尚不明确。2015年1～6月，我们采用吸入氢气处理失血性休克大鼠，观察其肺组织AQP-1、AQP-5的表达变化，探讨吸入氢气治疗失血性休克急性肺损伤的机制。

1材料与方法

1.1动物与分组成年雄性SD大鼠40只，体质量230～280 g。通过随机数字法分为假手术对照组(CON组)、失血性休克组(SH组)、1%氢气组(1%H2组)及2%氢气组(2%H2组)，每组各10只。

参考文献1.2失血性休克模型制备SH组、1%H2组及2%H2组[6]制备大鼠失血性休克模型。大鼠称重后，腹腔注射20%乌拉坦(0.5 mL/100 g)进行麻醉，右侧腹股沟区备皮后分离股动脉、股静脉，分别置入套管。除CON组外，其他各组经股动脉套管放血制备失血性休克模型。连接MP150多导生理信号记录仪监测平均动脉压(MAP)，放出的血液加入肝素储存于容器中备用，股静脉用于回输血液和复苏液体。置管成功后，经股动脉导管10 min内放血，维持MAP于40 mmHg，维持休克状态1 h。维持休克状态时，如血压高于45 mmHg则放部分血液，血压低于35 mmHg则回输少量血液。1 h后回输全部放出的血液并补等容量的乳酸林格氏液进行复苏，以维持MAP>80 mmHg为复苏成功的标志。CON组只进行置管不进行放血，其他操作与SH组相同。

1.3氢气干预方法参照文献[7]使用M177021氢气发生器电解水产生氢气，纯度约为99.999%。实验开始时将大鼠放入具有入气口和出气口的密闭箱子，将氢气与氧气混合气体经入气口输入箱子里，在出气口收集残气。使用JSA8-H2氢气检测仪检测出气口处氢气的浓度，调节到相应的氢气浓度。1%H2组和2%H2组分别在模型制作过程中吸入1%、2%的氢气，其他组操作中不吸入氢气。

1.4氧合指数(PaO2/FiO2)测算复苏2 h时，采集各组动脉血，使用i-STAT300型血气分析仪行血气分析，测算PaO2/FiO2。

1.5肺组织肺湿干重比(W/D)测算采集动脉血后立刻处死各组大鼠，取肺组织，剪下右肺下叶组织，用滤纸吸干表面水分后称湿重，然后放入80 ℃烤箱烤24 h至恒重后称干重，计算W/D。

1.6肺组织病理评分取右肺中叶，用预冷的生理盐水将肺组织冲洗干净，用4%甲醛溶液固定后进行HE染色。参照文献[8]光镜下观察肺组织，观察中性粒细胞浸润、肺泡内充血、肺间质水肿和肺泡水肿情况，分别对各项病理改变进行病理评分：无改变或改变非常轻微计0分；轻度改变计1分；中度改变计2分；重度改变计3分；极重度改变计4分。计算4项病理改变指标的总分，每张切片随机选择10个视野，取总分平均值。

1.7肺组织AQP-1、AQP-5蛋白表达检测取左肺组织，称重后加入9倍预冷的生理盐水，制成10%组织匀浆，离心后取上清液。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺组织AQP-1、AQP-5蛋白的表达。

2结果

SH组、1%H2组、2%H2组W/D、肺组织病理评分均高于CON组，PaO2/FiO2、AQP-1蛋白、AQP-5蛋白均低于CON组(P均<0.05)。1%H2组及2%H2组W/D、肺组织病理评分均低于SH组，PaO2/FiO2、AQP-1蛋白、AQP-5蛋白均高于SH组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组肺组织W/D、PaO 2/FiO 2、病理评分、AQP-1蛋白、AQP-5蛋白比较

注：与CON组比较，*P<0.05；与SH组比较，#P<0.05。

3讨论

失血性休克及复苏过程中极易诱发急性肺损伤，其机制众多。既往研究发现，即使在失血性休克后无感染发生，急性肺损伤的发生率仍较高(约40%)，肺内水的渗出与吸收失衡是急性肺损伤发生的重要原因[9]。

氢气是一种电中性小分子物质，具有较好的细胞膜通透性，能自由进入细胞内发挥一定的生理作用。研究证明，氢气具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等多种作用，在各种器官保护中发挥重要作用[10]。最近有研究表明，氢气能减轻各种肺损伤[11,12]。本研究发现，SH组W/D、肺组织病理评分高于CON组，PaO2/FiO2低于CON组，提示失血性休克后可以导致肺组织损伤；1%H2组及2%H2组W/D、肺组织病理评分低于SH组，PaO2/FiO2高于SH组，提示吸入氢气后能减轻肺组织的水肿程度、减轻肺损伤，并能改善肺功能，说明吸入氢气可以改善失血性休克大鼠肺损伤的程度。

AQP是一种存在于细胞膜上对水具有特异通透性的膜蛋白，对肺内水平衡调节具有重要作用[13,14]。其中AQP-1和AQP-5为专一水通道蛋白，仅能转运水蛋白，广泛存在于各系统中。AQP-1主要存在于肺泡毛细血管内皮细胞及脏层胸膜间皮细胞上，主要清除支气管和脉管周围的的水分[15]。AQP-5主要存在于Ⅰ型肺泡上皮细胞内，主要功能是清除肺泡内的水分[16]。但吸入氢气是否对休克后肺损伤中AQP具有调控作用尚不明确。本研究发现，1%H2组和2%H2组AQP-1、AQP-5蛋白表达高于SH组，提示吸入氢气能提高肺组织中AQP-1及AQP-5，可能与其减轻肺损伤有关，推测吸入氢气可能通过促进AQP-1和AQP-5蛋白的表达，发挥减轻失血性休克后肺损伤的作用。

综上所述，吸入氢气可能通过促进肺组织中AQP-1和AQP-5蛋白的表达，从而减轻失血性休克大鼠肺损伤的程度。

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