树脂XAD-16对埃博霉素B的解吸附条件优化

龚国利, 赵婷峰

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安　710021)



树脂XAD-16对埃博霉素B的解吸附条件优化

龚国利, 赵婷峰

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安710021)

摘要：埃博霉素B是一种由粘细菌纤维堆囊菌产生的新型抗肿瘤药物，目前埃博霉素B的发酵生产主要采用原位分离发酵工艺，即在发酵过程中将产生的埃博霉素B从发酵液中不断地吸附到大孔树脂上.本文以吸附有有效成分埃博霉素B的大孔树脂XAD-16为研究对象，确定出其最适解吸附条件.通过实验得出：重复3次解吸已基本将埃博霉素B完全解吸到溶剂中，80%甲醇溶液的解吸附能力最适，解吸附时间为120 min，解吸附pH为6.0，最适解吸附的转速为200 r/min.该条件的确定无论对实验室还是对于工业化条件下的埃博霉素的提取都具有一定的指导意义.

关键词：埃博霉素B; 大孔树脂; 解吸附; 高效液相色谱法

0引言

埃博霉素B(Epothiones B)是一类粘细菌纤维堆囊菌产生的天然大环内酯类物质[1,2]，具有抗肿瘤作用[3]，对多药耐药性细胞(包括耐紫杉醇类的细胞)具有明显的细胞毒活性[4].目前，埃博霉素B的发酵生产主要采用原位分离发酵工艺[5]，也就是在发酵过程中将产生的埃博霉素B连续不断地吸附到大孔树脂上，目的是解除其对菌体生长的抑制效应[6,7].在发酵结束后，收集树脂，并对吸附有埃博霉素的树脂进行解吸，再对解吸液进一步分离纯化而得到的.

大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂[8],普遍应用于天然产物的分离纯化[9,10]，对埃博霉素的解吸附是分离纯化埃博霉素的第一步，也是关键的一步，然而对大孔树脂的解吸附研究报道极少.因此，合理优化大孔吸附树脂的解吸附条件，对从发酵液中分离纯化埃博霉素具有重要意义.

本课题组为了提高埃博霉素B的提取率及纯度，在前期研究工作的基础上，进一步对大孔吸附树脂XAD-16的解吸附条件进行优化，从而不仅可以提高埃博霉素B的纯度及生产效率，而且还大大地缩短了生产时间，节省了成本，为今后工业化生产奠定了良好的基础，具有较高的药用价值和广阔的应用前景.

1材料与方法

1.1材料

(1)大孔吸附树脂XAD-16：为弱极性的树脂，购自德国Sigma公司；

(2)纤维堆囊菌SoF5-76(Sorangium cellulosum SoF5-76)：本实验室筛选保存菌.

1.2主要试剂及仪器

(1)试剂：Epothilone B标准品购于Singma公司；甲醇，乙醇，HCl，NaOH等均为市售分析纯.

(2)仪器：恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；FA2014电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；YXJ-2高速电动离心机：金坛市精达仪器制造厂；Waters-2487-2420-1525高效液相色谱仪：美国Waters公司.C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm×5.0 um).液相色谱操作条件：以65%甲醇水作流动相，流速为1.0 mL/min，时间为30 min，上样量为20μL,检测波长为249 nm.

1.3试验方法

1.3.1树脂的预处理

首先，将大孔树脂XAD-16用体积分数为95%的乙醇溶液浸泡，置于摇床中震荡24 h，取出用蒸馏水反复洗涤3～4次，至无明显的乙醇味；接着再用体积分数为95%的乙醇溶液对树脂进行二次溶胀24 h后，蒸馏水洗涤至无乙醇味；最后，加入3%～5%HCl溶液浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性，再用3%～5%的NaOH溶液浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性，备用.

1.3.2样品的制备

将保藏在固体斜面培养基中的菌种接入放有已灭菌滤纸片的CNST平板上，培养5～7 d后，转接至液体M26培养基中培养3 d制成种子培养液，再将种子培养液按照5%(V/V)接种量接种到含2% XAD-16树脂的液体发酵培养基中，30 ℃培养5～7 d后过滤收集树脂.

向上述吸附有有效成分埃博霉素B的树脂中加入一定量的甲醇水溶液，置于摇床上于室温下以200 r/min的转速进行解吸附，一段时间后，取出过滤得到解吸液，并将其置于真空干燥箱中烘干，再加入少量甲醇复溶后离心，经0.45 um滤膜过滤后进行液相色谱测定.

1.3.3埃博霉素B含量的测定

埃博霉素B检测：采用HPLC定量分析，液相色谱条件为：色谱柱，YWG，C18，10μm，250×4.6 mm ；Waters-2487高效液相色谱仪；UV紫外检测器；检测波长，249 nm；流动相，甲醇∶水=65∶35(体积比)；上样体积，20μL ；时间，30 min；流速，1 mL/min.

埃博霉素B的定量测定采用本课题组已得到的标准曲线[11]，根据标准曲线中峰面积大小来换算得到埃博霉素B的量.方程如下：

Y=0.132X +0.003 5(R2=0.999 0)

式中：X—埃博霉素的量;Y—埃博霉素的峰面积.

1.3.4静态吸附及解吸试验[12，13]

(1)静态吸附.称取不同量的树脂各3份，置于埃博霉素B样品溶液中，于摇床上震荡24 h后，经0.45 um滤膜过滤后，通过液相色谱测定残余液中埃博霉素B的量.

吸附量：Q1=(C1-C2)V/W1

吸附率：E=C1V -C2V/C1V×100%

式中：C1为吸附前样品液的起始浓度(mg/mL)；C2为吸附后残余液的浓度(mg/mL)；V为加入埃博霉素B溶液的体积(mL)；W1为树脂的质量(g).

(2)静态解吸.取静态吸附试验完毕后的树脂，置于250 mL锥形瓶中，加入一定量的解吸液，置于摇床200 rpm震荡2 h后，经0.45 um滤膜过滤后，通过液相色谱测定解吸液中埃博霉素B的含量.

解吸量：Q2=CV/W2

解吸率：D=CV/W×100%

式中：C为解吸液浓度(mg/mL)；V为解吸液体积(mL)；W2为大孔树脂的重量(g)；W为吸附在树脂上的埃博霉素B的总量(mg).

2结果与讨论

2.1XAD-16大孔吸附树脂的吸附量及吸附率

分别称取1 g、2 g、3 g、4 g、5 g XAD-16大孔吸附树脂加入到埃博霉素B样品溶液中，置于摇床上震荡24 h后，经0.45 um滤膜过滤后，通过液相色谱测定残余液中埃博霉素B的量.如图1所示，横坐标为树脂的量，纵坐标分别是吸附量Q1和吸附率E.

图1　不同树脂的量对吸附能力影响

由图1可见，吸附量Q1和吸附率E随着树脂量W1的增加而呈现先增后缓的趋势，在W1为3 g处达到最大值，即分别达到20.18 mg/g、73%.这是由于该溶液在3 g树脂下其吸附量几乎接近于饱和状态，再增加树脂的量对吸附量影响不太大，所以曲线呈现先增后缓的趋势.因此树脂的量选用3 g作为下一步解吸实验的基本条件.

2.2解吸次数对埃博霉素B的解吸附能力影响

分别称取3.0 g吸附有有效成分的XAD-16大孔吸附树脂于250 mL玻璃三角瓶,向其中加入100 mL的解吸剂甲醇溶液，过滤后将每次的解吸液于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇复溶并经0.45 um滤膜过滤后进行液相色谱测定5种情况下解吸液中埃博霉素B的含量.平行实验3次.如图2所示，横坐标为解吸次数，纵坐标分别是解吸量Q2和解吸率D.

由图2可见，解吸量Q2和解吸率D随着解吸次数的增多皆逐渐增大.当解吸3次之后解吸量Q2及解吸率D分别达到15.5 mg/g、72.5%，若继续增加解吸次数，Q2和D也都基本保持不变.因此，为了节省时间和有机溶剂用量，选取3次作为最适解吸次数.

图2　解吸次数对解吸能力影响

2.3不同浓度甲醇溶液对埃博霉素B的解吸附能力影响

不同浓度的甲醇溶液对埃博霉素B的解吸附能力具有一定的影响[14].将50%、60%、70%、80%、90%、100%的不同浓度甲醇水溶液100 mL加入到 XAD-16大孔吸附树脂，置于摇床上以200 r/min解吸附120 min，过滤后将解吸液于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇复溶并经0.45 um滤膜过滤后进行液相色谱测定.平行实验3次.如图3所示，横坐标为甲醇浓度，纵坐标分别是解吸量Q2和解吸率D.

图3　不同甲醇浓度对解吸能力影响

由图3可见，解吸量Q2和解吸率D随着甲醇浓度的增大呈现先增后趋于平缓.当甲醇浓度低于或等于50%时，不能将有效成分从大孔树脂上解吸下来；当甲醇浓度高于50%时有效成分开始被解吸下来；当甲醇浓度达到80%时，Q2和D均达到最大值，但继续增加甲醇浓度，Q2和D并未继续增大.因此，从节省有机溶剂用量方面考虑最终选取80%甲醇溶液作为解吸附剂.

根据文献[15]报道：浓度为80%甲醇溶液对大孔树脂的解吸附能力较好，与本文得出的结论相一致.

2.4时间对解吸附能力的影响

分别称取3.0 g吸附有有效成分的XAD-16大孔吸附树脂于250 mL玻璃三角瓶中，向其中加入80%的甲醇水溶液100 mL，封口后置于摇床上于室温下以200 r/min进行解吸附，分别于30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min后，过滤将解吸液于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇复溶并经0.45 um滤膜过滤后进行液相色谱测定.平行实验3次.如图4所示，横坐标为解吸时间，纵坐标分别是解吸量Q2和解吸率D.

图4　时间对解吸附能力的影响

由图4可见，随着解吸时间的延长，解吸量Q2和解吸率D均逐渐增加，一开始解吸量Q2和解吸率D变化幅度较大，当达到120 min时,Q2和D均达到较大值分别为16.67 mg/g、83%；之后随着时间的延长，Q2和D稍有增加但变化不明显.比较解吸时间120 nm、150 nm和180 min解吸量比较高，三者之间无显著差异，解吸率都在80%以上，从节省时间提高效率的角度考虑，选取120 min作为最适解吸附时间.

2.5pH对解吸附能力的影响

分别称取3.0 g吸附有有效成分的XAD-16大孔吸附树脂于250 mL玻璃三角瓶中，向其中加入100 mL浓度为80%的甲醇解吸液，在pH计监控下分别调节解吸液的pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在摇床上于室温下振荡解吸附120 min，过滤收集解吸液，于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇复溶并经0.45 um滤膜过滤后进行液相色谱测定.平行实验3次.结果如图5所示，横坐标为解吸液的pH值，纵坐标分别是解吸量Q2和解吸率D.

图5　pH对解吸能力的影响

由图5可见，解吸量Q2和解吸率D随着pH的增大呈现先增后减的趋势.Q2和D在pH小于或大于6时，均小于pH=6时的值；当pH=6时,Q2和D几乎达到曲线的顶点，其值分别为16.33 mg/g、81.68%，此时的最大值比最小值分别高出68.87%、70.17%.因此，pH=6.0可作为最适解吸pH条件.

2.6转速对解吸附能力的影响

分别称取3.0 g吸附有有效成分的XAD-16大孔吸附树脂于250 mL玻璃三角瓶中，向其中加入100 mL浓度为80%的甲醇水解吸液，分别置于转速为100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min、350 r/min的摇床上于室温下振荡解吸附120 min，过滤收集解吸液，于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇复溶并经0.45 um滤膜过滤后进行液相色谱测定.平行实验3次.结果如图6所示，横坐标为摇床的转速，纵坐标分别是解吸量Q2和解吸率D.

由图6可知，随着转速的增大，解吸量Q2和解吸率D呈现先增大后减小的趋势，但减小的趋势不太明显.一开始可能是转速太小，埃博霉素B不能有效地被解吸，当转速达到200 r/min时解吸量Q2和解吸率D分别达到最大值，再随着转速的增大，Q2和D变化的幅度较小.因此，可以确定出解吸附的最适转速为200 r/min.

图6　转速对解吸能力的影响

3结论

本研究是采用原位吸附分离技术工艺，将有效成分吸附在大孔树脂上，主要讨论了大孔树脂的最适解吸附条件，并且采用了直接进行液相色谱检测的手段，不仅提高了分析速度，而且提高了检测方法的灵敏度和准确度，为试验结果提供了可靠的数据支撑.最终确定出最适的解吸附条件为：最适解吸次数为3次，解吸剂甲醇溶液的浓度为80%，解吸时间为120 min,解吸pH为6.0，解吸转速为200 r/min.该结论对本有效成分的分离纯化，以及后期想要获得更高纯度的物质具有重要的指导意义.

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Optimization of desorption conditions for epothilone

B desorbed from macroporous resin XAD-16

GONG Guo-li， ZHAO Ting-feng

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:Epothilone B is a novel anti-tumor drugs produced by myxobacteria sorangium cellulosum.Now,epothilone B is produced through in situ separation of fermentation that epothilone B is adsorbed on macroporous resin continuously from fermentation liquor in the fermentation process.In this paper,macroporous resin XAD-16 with effective components of epothilone B were the main study object, and the best desorption conditions were determined.The results were as follows:the epothilone B had been basically complete desorbed to the solvent when desorption times was 3,80% aqueous methanol solution had the best adsorption ability,the best adsorption time was 120 min,the best adsorption pH was 6.0,the adsorption speed was 200 r/min.The conclusion had certain guiding significance both for laboratory and for industrialized extraction of epothilone.

Key words:epothilone B; macroporous resin; desorption; high performance liquid chromatography

中图分类号：Q815

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2015)02-0121-05

作者简介:龚国利(1976-)，男，内蒙古丰镇人，教授，博士，研究方向：应用微生物技术

基金项目：国家自然科学基金项目(20906058)； 陕西科技大学学术骨干培育计划项目(XSG2010009)

收稿日期:*2015-01-12