非小细胞肺癌胸腔积液中ERCC1、XRCC1表达与铂剂疗效的相关性研究

非小细胞肺癌专题

非小细胞肺癌胸腔积液中ERCC1、XRCC1表达与铂剂疗效的相关性研究

孔雁，左静，刘亮，刘荣风，姜达

作者单位： 050000石家庄，河北医科大学第四医院肿瘤内科(孔雁、左静、刘荣风、姜达)，流式细胞室(刘亮)

通信作者： 姜达，E-mail:329502837@qq.com

【摘要】目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)恶性胸腔积液中ERCC1、XRCC1表达水平与铂类药物化疗疗效及预后关系。方法收集2012年3月—2014年3月给予铂类药物方案治疗的伴有恶性胸腔积液的晚期NSCLC患者82例，采用流式细胞术检测胸水标本中ERCC1、XRCC1蛋白表达水平，Kaplan-Meier生存曲线分析比较不同ERCC1和XRCC1表达水平患者的中位生存期(OS)和无病进展时间(PFS)。结果ERCC1的阳性率为41.5%(34/82), XRCC1的阳性率为34.1%(28/82)。ERCC1阴性表达者含铂方案的化疗效果优于阳性表达者, 但两者间比较差异无统计学意义(χ2=0.63，P=0.43); XRCC1阴性表达者含铂方案的化疗效果优于阳性表达者, 两者间比较差异亦无统计学意义(χ2=0.01，P=0.93)。ERCC1和 XRCC1阴性表达的患者OS明显长于阳性表达者(χ2=5.91,P<0.05),PFS亦明显长于阳性表达者(χ2=15.31,P<0.05)。结论胸腔积液中肿瘤细胞ERCC1、XRCC1表达与晚期非小细胞肺癌的预后具有相关性，与铂剂化疗疗效的关系尚待进一步明确。

【关键词】ERCC1；XRCC1；非小细胞肺癌；胸腔积液；铂剂

基金项目:河北省卫生厅医学科学研究重点课题(No.20120372)

DOI【】10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.08.001

收稿日期：(2015-05-11)

Correlation between ERCC1, XRCC1 expression and platinum in non-small cell lung cancer with malignant pleura effusionKONGYan*,ZUOJing,LIULiang,LIURongfeng,JIANGDa.*DepartmentofOncology,TheForthHospitalAffiliatedHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Correspondingauthor:JIANGDa,E-mail:329502837@qq.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the relationship between ERCC1, XRCC1expression level in malignant pleural effusion of non-small cell lung cancer (NSCLC) and the efficacy of platinum based chemotherapy and prognosis.MethodsFrom 2012 March to 2014 March, 82 cases receiving platinum drug regimens for the treatment of malignant pleural effusion of advanced NSCLC were enrolled, using flow cytometry to test ERCC1, XRCC1 protein expression level in pleural effusion,using Kaplan-Meier survival curve analysis to compare different ERCC1 and XRCC1 expression level in patients with median survival (OS) and stage to disease free progression (PFS).ResultsThe positive rate of ERCC1 was 41.5% (34/82), the positive rate of XRCC1 was 34.1% (28/82). ERCC1 negative expression with platinum based chemotherapy was more effective than the positive expression of persons, but no significant difference between the two regime (χ2=0.63,P=0.43); XRCC1 negative expression contain platinum based chemotherapy was more effective than the positive expression, no significant difference were found between the two regime (χ2=0.01,P=0.93). The negative expression of ERCC1 and XRCC1 patients’ OS was significantly longer than the positive expression patients (χ2=5.91,P<0.05); PFS also was significantly longer than that of the positive expression patients (χ2=15.31,P<0.05).Conclusion Pleural effusion’s tumor cells of ERCC1, XRCC1 expression is related to the prognosis of late stage small cell lung cancer, and the relationship with platinum agent chemotherapy remains unclear.

Keywords【】 ERCC1; XRCC1; Non-small cell lung cancer; Pleural effusion; Platinum

随着靶向治疗时代的到来，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的治疗在很大程度上实现了个体化，然而对于靶标阴性或者靶向治疗失败的患者，含铂类双药的化疗仍是最主要的治疗手段之一。目前临床上尚无有效检测方法应用于化疗药物的筛选，故化疗方案的选择有一定盲目性。已有研究表明，肺癌组织中DNA 修复基因核苷酸切除修复交叉互补基因 1(excision repair cross complementation group 1, ERCC1)、X射线交叉互补修复基因1 (X-ray repair cross complementation group 1, XRCC1)不仅是生存预后指标，也可能预测含铂化疗方案的疗效。我们通过检测NSCLC患者恶性胸腔积液中ERCC1、XRCC1表达水平，研究其不同表达情况与铂类为主的化疗方案疗效及预后的关系。现将结果报道如下。

1资料与方法

1.1临床资料收集2012年3月—2014年3月我院收治的存在恶性胸水的晚期肺癌患者82例，均为初治患者，经病理学诊断并确诊，临床分期为IV期，功能状态(performance status,PS)评分0~2分。一线给予含铂类药物方案化疗。82例患者中男 44例，女38例，男女比例1.16∶1。鳞癌 29例，腺癌 53例。随访至 2014年 12月，随访率为100%, 其中死亡 43例，存治39例。

1.2方法

1.2.1标本采集与处理： 通过胸腔穿刺引流收集胸水标本500 ml，应用肿瘤细胞采集器收集肿瘤细胞，取出滤膜涂片2张, 通过 HE 染色进行细胞学诊断。然后将滤膜放入盛有10 ml PBS 离心管中涮洗滤膜,1 000 r/min离心5 min, 弃上清。加入适量的PBS调整细胞浓度为1×106/ml，制成单细胞悬液, 进行流式检测。如不能及时检测, 可加入70%乙醇固定，4℃冰箱长期保存。

1.2.2流式细胞术检测ERCC1、XRCC1的蛋白表达： 吸取单细胞悬液0.1 ml,加入单克隆抗体ERCC1、XRCC1工作液0.1 ml，室温孵育30 min,加入PBS缓冲液10 ml洗涤1次(去除未与细胞结合的一抗),离心弃上清,加入二抗工作液100 μl, 避光室温孵育30 min, 加入PBS缓冲液10 ml离心,弃上清(以除去未与一抗结合的二抗),然后加入 PBS 1 ml经500目铜网过滤后上机检测荧光的强弱。该实验需设细胞悬液只加入一抗或二抗作阴性对照或本底对照。

1.2.3ERCC1、XRCC1的蛋白表达量判定： 以荧光指数(fluoresence index,FI)表示它们的相对含量，公式为FI=(样品蛋白表达的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/正常对照样品平均荧光强度。如果FI>1.0为阳性表达, FI≤1.0为阴性表达。

1.3疗效评价(1)疗效按实体瘤疗效评价标准(RECIST 1.1)[1]: 完全缓解(CR)、 部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)。近期客观有效率为RR=(CR + PR)/总例数×100%, 有效者1个月后检查确认。(2)总生存期与无进展生存期统计：总生存期(overall survival，OS)为自治疗开始到患者死亡或失访, 若末次随访仍然存活则定为截尾值；无进展生存期(progression free survival，PFS)为自治疗开始到疾病进展,均以月为单位计算。

1.4统计学方法应用 SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计数资料以率表示，采用χ2检验,采用Kaplan Meier生存分析法进行单因素生存分析，并进行 Log-rank时序检验,采用Spearman相关分析检测ERCC1和XRCC1表达水平的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1ERCC1、XRCC1表达及与临床病理特征的关系82例NSCLC患者中，ERCC1阳性表达34例，XRCC1阳性表达28例，阳性表达率分别为41.5%(34/82)、34.1%(28/82)。经χ2检验，与性别、年龄、组织类型、淋巴结转移均无相关性(P>0.05)。见表1。

表1　NSCLC患者胸腔积液中ERCC1、XRCC1

2.2ERCC1、XRCC1表达与化疗疗效的关系82例患者中一线含铂方案化疗后PR 18例(22.0%),SD 43例(52.4%),PD 21例(25.6%)，总客观缓解率RR为22.0%。ERCC1表达阳性34例患者中，RR为17.6%(6/34)，表达阴性48例患者中，RR为25.0%(12/48)，两者比较差异无统计学意义(χ2=0.63，P=0.43)。XRCC1表达阳性患者中，RR为21.4%(6/28)，表达阴性患者中，RR为22.2%(12/54)，两者比较差异无统计学意义(χ2=0.01，P=0.93)。各组间SD、PD患者比较差异亦无统计学意义，见表2。

2.3ERCC1、XRCC1表达与生存期的关系82例患者中死亡43例，中位OS为15.6个月，中位PFS为4个月。ERCC1阳性表达组中位OS为8.1个月，中位PFS为2.4个月;ERCC1阴性表达组中位OS为14.3个月，中位PFS为4.5个月，两者OS间差异有统计学意义(χ2=5.91，P=0.02)，PFS间差异亦有统计学意义(χ2=15.31，P=0.000)。XRCC1阳性表达组中位OS为8.8个月，中位PFS为2.5个月;XRCC1阴性表达组中位OS为15.3个月，中位PFS为4.7个月，两者OS间差异有统计学意义(χ2=6.30，P=0.01)，PFS间差异有统计学意义(χ2=11.84，P=0.001)。见图1、2。

表2　NSCLC患者胸腔积液中ERCC1、XRCC1

图1　ERCC1不同表达情况的Kaplan-Meier总生存曲线图

图2　XRCC1不同表达情况的Kaplan-Meier总生存曲线图

2.4ERCC1与XRCC1表达的相关性分析经Spearman相关性分析显示, ERCC1和XRCC1的表达无相关性(r=0.23,P>0.05)。

3讨论

含铂双药是非小细胞肺癌治疗中不可或缺的重要药物，与靶向治疗相比，尚缺乏明确的可以预测化疗疗效及不良反应作用的生物标记物，这是造成化疗盲目性的主要原因。近年来，有关铂类药物化疗标记物的研究正如火如荼的进行着，其中ERCC1与XRCC1作为参与DNA修复的2个关键基因是目前研究的热点。

铂类药物主要作用于肿瘤细胞DNA分子的鸟嘌呤，通过与DNA 结合形成铂类—DNA复合物，干扰肿瘤细胞DNA的合成，并且产生细胞毒性作用[2]。ERCC1是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)途径的关键基因，而NER途径是 DNA修复的主要途径[3]，通过这条通路能够阻断铂类和DNA结合，并且能修复DNA 链间的交联，最终导致耐药的发生。XRCC1是DNA修复的另一主要途径即碱基切除修复(base excision repair,BER)途径的重要基因，通过与多种碱基切除修复相关蛋白(如 DNA 聚合酶β、PARP1等)结合形成复合物，共同参与因氧化剂及烷化剂导致的 DNA 单链断裂和碱基损伤修复，对维持基因组的稳定起关键作用，并参与铂剂引起的 DNA 损伤修复过程[4]。

目前,多项研究表明，肺癌组织中ERCC1、XRCC1表达水平,与铂剂为主的化疗方案的疗效具有相关性，体外试验也证实恶性胸腔/腹腔积液中肿瘤细胞的ERCC1 mRNA的表达水平与顺铂体外药物敏感性相关，临床中可将其作为含铂类方案化疗敏感性及预后的预测指标之一[5]。晚期肿瘤患者组织标本常不易取得，但多易出现恶性胸腔积液，其中含有大量肿瘤细胞，有关恶性胸腔积液中ERCC1、XRCC1表达水平与铂类药物化疗疗效关系的临床研究甚少。

我们通过收集肺癌胸腔积液中的肿瘤细胞，测定ERCC1、XRCC1蛋白表达情况。研究发现，ERCC1、XRCC1蛋白的阳性表达与性别、年龄、组织学类型、淋巴结转移无关，这与李亮亮等[6]的报道一致。ERCC1与铂剂疗效及肿瘤预后的关系报道不一。Simon等[7]研究发现ERCC1表达水平与铂类化疗的效果及生存期呈负相关，表达水平越低，其对铂类用药的敏感性越高，生存期越长。周崧雯等[8]采用免疫组化法检测手术切除的73例 NSCLC患者肿瘤组织中 ERCC1的表达水平, 发现 ERCC1阳性表达患者的 5年生存率要优于阴性者, 但差异无统计学意义(P=0.32)。本研究结果提示, ERCC1阴性表达者可获得更长的PFS和OS (P<0. 05)，与李亮亮等[6]的研究结果一致。表达阴性者疾病缓解率较高，但差异无统计学意义，与Bepler等[9]研究结论相近。刘晓晴[10]总结近年的临床研究发现，ERCC1免疫组化表达及ERCC1(C8092A、 C118T)多态性与铂类药物疗效无关，周国仁等[11]研究显示ERCC1(118)C/C基因型患者对顺铂类药物的敏感性较C/T+T/T基因型患者高。分析疗效存在差异的原因可能与其蛋白、基因及多态性等不同检测水平有关，不同位点的多态性亦存在差异，今后需进一步研究各个多态性位点与铂剂疗效的相关性。与预后关系存在分歧可能与DNA 修复能力在不同分期肿瘤作用不同有关，DNA 修复能力是与肿瘤易感性和化疗敏感性密切相关的双刃剑，在肿瘤早期，DNA 修复能力越强，肿瘤易感性越低，预后越好，然而在肿瘤治疗过程中，DNA 修复能力的增加却阻碍了疗效的发挥，导致不良预后[12]。

在胃癌研究中证实，XRCC1阴性表达的患者可以从化疗中获益[13]，生存期高于阳性表达患者。姚成云等[14]的研究也证实携带特定基因型的患者使用含铂方案化疗可能有更高的有效率和更长的生存期。而Tiseo等[15]的研究证实XRCC1是晚期NSCLC一线化疗的预后因素，而非铂类化疗的预测因素。本研究结果提示XRCC1阴性表达者PFS和OS较阳性表达者长(P<0. 05)，而疾病缓解率无明显差别，研究结论存在分歧同样可能与其蛋白、基因及多态性等不同检测水平有关。XRCC1与ERCC1二者之间无明显相关性。

综上所述，我们的研究发现胸腔积液中肿瘤细胞ERCC1、XRCC1表达与非小细胞肺癌的预后具有相关性，与铂剂化疗疗效的关系仍待开展不同检测水平的多中心、随机化、前瞻性的临床研究进一步明确。对于伴有恶性胸腔积液而无法获得组织标本的非小细胞肺癌患者而言, 以胸腔积液为基础对相关预后、疗效预测分子进行分析,是一条可行的途径。随着单细胞基因组学等检测手段的不断进步，这一研究领域将变得更加广阔。

参考文献

1Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J,et al.New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1)[J].Eur J Cancer,2009,45(2):228-247.

2Hildebrandt MA,Gu J,Wu XF.Pharmacogenomics of platinum-based chemotherapy in NSCLC[J].Expert Opin Drug Metab Toxicol,2009,5(7):745-755.

3Roth JA,Carlson JJ.Prognostic role of ERCC1 in advanced non-small-cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis[J].Clin Lung Cancer,2011,12(6):393-401.

4Rosell R,Lord RV,Taron M,et al.DNA repair and cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer[J].Lung Cancer,2002,38(3):217-227.

5王立峰,殷海涛,钱晓萍,等.恶性胸腔和腹腔积液中ERCC1和BRCA1 mRNA的表达水平与顺铂敏感性的关系[J].肿瘤,2010,30(3):226-231.

6李亮亮,刘晓晴.非小细胞肺癌组织中ERCC1和RRM1表达与吉西他滨/顺铂疗效及预后的关系[J].军事医学科学院院刊,2010,34(3):265-268, 296.

7Simon GR,Schell MJ,Begum M,et al.Preliminary indication of survival benefit from ERCC1 and RRM1-tailored chemotherapy in patients with advanced nonsmall cell lung cancer:evidence from an individual patient analysis[J].Cancer,2012,118(9):2525-2531.

8周崧雯,周彩存,徐清华,等.非小细胞肺癌中ERCC1的表达与新辅助化疗疗效之间的关系[J].中国肺癌杂志,2008,11(2):251-255.

9Bepler G,Williams CC,Schell ML,et al.Molecular analysisdirected,international,phase Ⅲ trial in patients with advanced non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2013,31(15s):8001.

10刘晓晴.ERCC1/BRCA1表达与基因多态性对是否使用顺铂化疗的晚期非小细胞肺癌患者的预后及预测价值[J].循证医学,2013,13(4):207-210.

11周国仁,冯继锋,陆建伟,等.和多态性与进展期非小细胞肺癌对铂类化疗的敏感性XRCC1,ERCC1单核苷酸多态性与非小细胞肺癌对铂类化疗的敏感性[J].海南医学院学报,2014,20(1):20-24.

12Wei Q,Frazier ML,Levin B,et al.DNA repair:adouble-edged sword[J].J Natl Cancer Inst,2000,92(6):440-441.

13Wang S,Wu X,Chen Y,et al.Prognostic and predictive role of JWA and XRCC1 expressions in gastric cancer[J].Clin Cancer,2012,8(10):2987-2996.

14姚成云,黄新恩,黎超,等.在晚期非小细胞肺癌中XRCC1和XPD基因多态性的联合和铂类化疗的关系[J].徐州医学院学报,2010,30(6):391-396.

15Tiseo M,Bordi P,Bortesi B,et al.ERCC1/BRCA1 expression and gene polymorphisms asprognostic and predictive factors in advanced NSCLC treated with or without Cisplatin[J].Br J Cancer,2013,108(8):1695-1703.

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