灰树花多糖联合顺铂诱导HeLa细胞凋亡

灰树花多糖联合顺铂诱导HeLa细胞凋亡

吕冬霞罗文哲刘娜1范晓艳魏凤香2

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探讨灰树花多糖(PGF)联合顺铂(DDP)诱导HeLa细胞凋亡及其可能的分子机制。方法四甲基偶氮唑蓝比危法(MTT)检测细胞增殖抑制率，RT-PCR法检测survivin和caspase-3 mRNA的表达。结果MTT法显示，联合用药抑制率均高于单药组(P<0.05)。PGF 0.05 mg/L与DDP 1 mg/L联合作用24 h时，Q>1.15； RT-PCR显示，联合用药组与两单药组比较 survivin mRNA 表达下调，caspase-3 mRNA 表达上调。结论联合用药对HeLa细胞的抑制率较单独用药组有明显提高。联合用药24 h时点，二者有协同作用。联合用药诱导HeLa细胞凋亡可能与凋亡基因survivin表达下调和caspase-3基因表达上调有关。

关键词〔〕灰树花多糖；顺铂；细胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

中图分类号〔〕R730.52〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省卫生厅研究项目(No.2009-343)

通讯作者：魏凤香(1974-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事肿瘤发生机制与生物学治疗研究。

1白城实验中学2深圳龙岗区妇幼保健院

第一作者：吕冬霞(1965-)，女，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤发生机制与生物学治疗研究。

灰树花多糖(PGF)具有改善免疫系统功能、抑制肿瘤、调节血糖等功能〔1〕。顺铂(DDP)广泛应用于多种实体瘤的治疗中且疗效确切。本研究探讨PGF联合DDP对HeLa细胞敏感作用及其可能的机制，为临床治疗宫颈癌提供新思路。

1材料与方法

1.1材料人宫颈癌HeLa细胞购于武汉大学典型培养物冷藏中心。其他主要仪器及试剂有：净化工作台(苏州净化设备厂)、二氧化碳培养箱(SHEL LAB2300，美国)、倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)、酶标仪(LABSYSTEMS)、PCR仪( PE-5700，美国)、电泳仪(北京六一仪器厂)、电泳槽(北京东方仪器)、流氏细胞仪(美国BD公司)；小牛血清与RPMI-1640培养液(杭州四季青)，二甲基亚砜 (DMSO，Amersco)、MTT(上海普飞生物技术有限公司)、灰树花多糖粉末(浙江方格药业有限公司)、顺铂粉剂(山东齐鲁制药厂)、总RNA提取与RT-PCR试剂盒(大连宝生物)，细胞凋亡试剂盒(南京凯基公司)。

1.2细胞培养使用含10%灭活小牛血清的RPMI-1640完全培养液培养细胞。常规方法传代。

1.3四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖抑制率及评价联合用药效果取对数生长期HeLa细胞移入96孔培养板中，细胞密度1×104个/ml，每孔加入200 μl细胞悬液，37℃、5%CO2的培养箱中培养。24 h后，弃去原培养液，分别加入不同浓度的PGF或DDP的RPMI1640培养液200 μl。PGF组中，加入不同浓度的多糖溶液，其终浓度分别为0.01、0.05、0.1 mg/L；DDP组中，加入不同浓度的顺铂溶液，其终浓度分别为0.25、0.5、1 mg/L；联合用药组中，取PGF溶液为0.05 mg/L，分别与DDP0.25、0.5、1 mg/L联合；空白对照组中仅加10%小牛血清的RPMI1640培养液。每个浓度设立8个复孔，把培养板移入培养箱中培养，经过12、24、48 h 后分别加入MTT(5 mg/L)20 μl，继续培养4 h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长酶联免疫仪检测，以空白孔调零，测定各孔吸光度值(OD)。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%；评价联合用药效果：q值=E(A+B)/EA+EB(1-EA)〔EA、EB、E(A+B)分别为PGF组、DDP组及联合组的抑制率〕。根据q值评价联合用药效果，若q<0.85 为拮抗，0.85~1.15为相加，q>1.15为协同。根据试验结果，找到一组有协同或相加作用的组合，以下试验均采用这一浓度药物。

1.4半定量RT-PCR检测survivin、caspase-3基因mRNA表达选取空白对照组、PGF 0.05 mg/L、DDP 1 mg/L、联合用药组为0.05 mg/L PGF和1 mg/L DDP、只加含10%小牛血清的RPMI1640培养液。药物作用24 h后，先提取细胞总RNA，再进行反转录反应，最后将逆转录产物cDNA进行PCR反应。引物设计参照文献〔2〕，PCR反应引物为survivin：正义5′-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CT-3，反义5′-GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA-3′；caspase-3：正义5′-GCT ATT GTG AGG CGG TTG T-3′，反义5′-CGT TTG GAG TCC CTT TGT-3′；β-actin：正义5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3′，反义5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统观察结果、拍照并分析。以β-actin的表达量为对照，计算并比较各组caspase-3及survivin的相对表达量。

1.5统计学方法采用SPSS11.5软件行t检验。

2结果

2.1MTT法检测细胞增殖抑制率及评价联合用药效果PGF对HeLa细胞的增殖抑制作用均有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。DDP对HeLa细胞的增殖抑制作用均有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。

根据上述实验结果，选取0.05 mg/L PGF分别与0.25、0.5、1 mg/L的DDP联合作用于HeLa细胞(其他组合有待后续研究中进行)，对照组加等量的培养基。 MTT比色法分析结果显示细胞增殖被抑制。PGF与DDP联合作用24 h时，抑制率均高于单药组(P<0.05)，其中0.05 mg/L PGF与1 mg/L DDP联合作用于24 h时的q值为1.17，表现出协同作用，其余均为相加作用。

2.2RT-PCR检测survivin、caspase-3基因mRNA表达与空白对照组比较，PGF组survivin表达降低，caspase-3 mRNA表达上调(P<0.05)。两药联合组caspase-3 mRNA的表达高于两单药组(P<0.05)，survivin mRNA的表达低于两单药组(P<0.01)，见表1。

组别caspase-3/β-actinsurvivin/β-actin空白对照组0.816±0.0874)0.931±0.0324)顺铂组1.117±0.0252)3)0.716±0.0372)4)PGF1.016±0.0761)3)0.826±0.0471)4)联合组1.214±0.0532)0.550±0.0492)

与空白对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01;与联合组比较:3)P<0.05，4)P<0.01

3讨论

本实验结果提示PGF对DDP可能起到增敏作用。诱导细胞凋亡的因素很多，凋亡抑制蛋白(IAP)是一种广泛表达的抑制凋亡的基因家族〔3，4〕，在功能上具有抑制细胞凋亡的作用。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，在绝大多数肿瘤组织中表达。Caspase是细胞凋亡的核心执行者〔5，6〕。Caspase-3属于效应Caspase〔7〕。本实验提示PGF和DDP激活细胞凋亡具有共同的途径，这可能是它们在一定的剂量时产生协同作用使PGF对DDP具有增敏作用。

4参考文献

1Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev，2001；6(1)：48-60.

2韦星，涂硕，万福生，等.白英乙醇提取物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其对凋亡相关基因表达的影响〔J〕.四川中医，2007；25(9)13-5.

3曹世龙.肿瘤学新理论与新技术〔M〕.上海：上海科技教育出版社，1997：463.

4Hejna M，Raderer M，Zielinski CC.Inhibition of metastases by anticoagulants〔J〕.J Natl Cancer Inst，1999；91(1)：22-36.

5Bradham CA，Qian T，Streetz K，etal.The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome C release〔J〕.Mol Cell Biol，1998；18(11)：6353-64.

6Rao RV，Hermel E.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.mechanism of caspase activation.〔J〕J Biol Chem，2001；276(36)：33869-74.

7Nicholson DW，Ali A，Thornberry NA，etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature，1995；376(1)：37-43.

〔2014-10-02修回〕

(编辑李相军/滕欣航)