基于生物信息学技术分析老年人颈动脉不稳定斑块差异基因表达谱

基于生物信息学技术分析老年人颈动脉不稳定斑块差异基因表达谱

奈文青丁宇张克伟1王媛媛单兰兰傅友吴洪渊丁燕戴萌

(南方医科大学南方医院，广东广州510515)

摘要〔〕目的探讨老年患者颈动脉不稳定斑块发生的分子机制。方法从ArrayExpress数据库下载基因表达谱数据集E-MTAB-2055。该数据包含24例颈动脉不稳定斑块和24例稳定斑块，分别来源于24例老年颈动脉粥样硬化患者。通过系列数据分析从中筛选差异表达基因，并通过富集分析获取与不稳定斑块有关的生物学过程和通路。同时，通过构建差异表达基因的生物网络寻找与该疾病高度相关的风险模块。结果不稳定斑块中发生显著性差异表达变化的基因共有439个，其中上调基因为232个，下调基因为207个。涉及到的生物学过程和通路大部分与炎症和免疫应答有关。生物网络和模块分析提示CXCR4、VCL和TYROBP 可能在老年患者不稳定斑块发生发展过程中发挥着重要作用。结论本研究比较完整地揭示了老年患者颈动脉不稳定斑块差异表达谱特征和涉及的生物学过程及信号通路，其中CXCR4、VCL和TYROBP可能参与不稳定斑块发生发展。

关键词〔〕不稳定斑块；动脉粥样硬化；基因表达谱；差异表达基因；生物信息学

中图分类号〔〕R543.4〔文献标识码〕A〔

基金项目：南方-哈佛“健康医疗云服务”平台关键技术创新、集成与应用(2013J4500040穗科信字〔2013〕184号)

通讯作者：戴萌(1963-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事血管衰老早期干预研究。

1河南省人民医院

第一作者：奈文青(1988-)，女，在读硕士，主要从事动脉粥样硬化早期干预研究。

越来越多的研究表明，急性心脑血管事件的发生不仅取决于动脉管腔的狭窄程度，更重要的决定因素是动脉粥样硬化(AS)不稳定斑块的形成〔1〕。不稳定斑块形成的病理生理学机制主要包括斑块内炎症反应的增加、新生血管形成和细胞大量凋亡，而诱导这些病理生理过程改变的分子机制并不完全清楚〔2，3〕。基因表达芯片技术可同时比较成千上万个基因的表达变化，全面筛选某一表型或某一疾病的所有相关基因，还可揭示不同基因表达变化之间的相互关系，从而为研究基因与基因之间的内在联系提供线索。本研究通过基因芯片技术分析获取老年患者不稳定斑块和稳定斑块间差异表达基因(DEGs)，并运用生物信息学方法分别在基因本体(GO)、通路和蛋白互作网络中分析不稳定斑块形成的分子机制，旨在寻找该疾病相关生物学过程、通路和风险模块。

1材料与方法

1.1数据来源及样本描述本研究使用的E-MTAB-2055数据集来源于ArrayExpress数据库(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)，采用的芯片是A-MEXP-931-Illumina HumanRef-8 v2 Expression BeadChip。

该芯片数据的样本包含24例晚期稳定斑块组织和24例不稳定斑块组织，均来源于经颈动脉内膜剥脱术后患者病变血管，获取的斑块组织经病理学鉴定分为稳定斑块和不稳定斑块两部分，病人年龄61~83岁，平均68.69岁，上述所取血管组织包含血管内膜和中膜，不包含血管外膜〔4〕。

1.2数据处理方法

1.2.1表达谱数据预处理从ArrayExpress数据库中下载E-MTAB-2055的CEL文件后，分别在R软件(R3.0.0)中运行Lumi包〔5〕和Limma包〔6〕，并使用包中的线性模型方法、经验Bayes算法和归一化算法分别对探针水平的信号值进行质控、变异稳定性分析、背景矫正、数据归一化和基因注释，最终转化为基因水平的表达值。

1.2.2获取DEGs使用t检验和倍比法(FC)识别DEGs。DEGs筛选阈值为P≤0.01且|logFC|>1。

1.2.3DEGs功能富集分析通过DAVID网站〔7〕(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)提交基因表达谱获取的DEGs分别进行GO语义〔8〕和KEGG通路〔9〕富集分析。筛选富集分析GO语义和KEGG通路的阈值分别为FDR≤0.01和P≤0.05。

1.2.4蛋白互作网络构建和寻找疾病相关模块首先从string〔10〕(版本号9.1)网站下载人类所有的蛋白互作关系列表，通过在R软件中对蛋白互作列表进行预处理如去冗余、自身互作等并保留互作可信度得分> 0.7的蛋白互作对，然后映射DEGs到蛋白互作网络，仅保留DEGs间的互作关系，获取DEGs在蛋白互作层面的生物网络。最后，将DEGs构建的生物网络导入到Cytoscape〔11〕(版本号2.8.2)实现生物网络可视化，并进行网络度的计算和查找疾病相关模块。

2结果

2.1筛选DEGs结果满足筛选阈值要求的DEGs共439个，上调基因232个，下调基因207个，差异表达上调基因倍比变化最大的基因是heme oxygenase 1(HMOX1，logFC=3.1)，差异表达下调基因倍比变化最大的基因是alpha-actin(ACTC1，logFC=-2.2)。

2.2生物学意义的分析结果

2.2.1DEGs功能富集分析结果GO富集分析结果显示共有15个生物学过程语义满足富集阈值要求，Term：response to wounding，defense response，immune response，inflammatory response，taxis，chemotaxis，cell adhesion，biological adhesion，locomotory behavior，cytoskeleton organization，muscle system process，actin cytoskeleton organization，actin filament-based process，negative regulation of cell proliferation,muscle contraction，均P<0.001，FDR<0.001。其中，免疫应答、免疫防御、炎症应答、细胞因子等富集显著性最高，位于富集结果最前面。

通路富集结果显示9个通路符合富集阈值要求(表1)。富集通路包括免疫系统相关通路(细胞因子信号通路、白细胞跨膜迁移通路、造血细胞谱系和补体凝血级联反应)、细胞过程(溶酶体通路、肌动蛋白细胞骨架调节)、环境信息处理(细胞因子-细胞因子受体互作)、内分泌系统通路(PPAR信号通路)和代谢(色氨酸代谢)。结果显示富集到的免疫相关通路数目最多，而富集显著性最高的通路是溶酶体通路。

表1差异表达基因富集KEGG通路结果

PathwayP值PathwayClassLysosome<0.001CellularProcesses;TransportandcatabolismChemokinesignalingpathway<0.001OrganismalSystems;ImmunesystemPPARsignalingpath-way<0.001OrganismalSystems;EndocrinesystemCytokine-cytokinere-ceptorinteraction0.002EnvironmentalInformationPro-cessing;SignalingmoleculesandinteractionLeukocytetransendo-thelialmigration0.004OrganismalSystems;ImmunesystemHematopoieticcellline-age0.006OrganismalSystems;ImmunesystemRegulationofactincy-toskeleton0.021CellularProcesses;CellmotilityComplementandcoag-ulationcascades0.023OrganismalSystems;ImmunesystemTryptophanmetabo-lism0.039Metabolism;Aminoacidmetab-olism

网络中圆形结点表示差异表达基因，边表示差异基因间互作，红色结点表示上调的DEG，蓝色结点表示下调的DEG 图1　差异表达基因构建蛋白互作网络

2.2.2DEGs映射蛋白互作网络和寻找疾病模块分析结果本研究利用STRING数据库提供的人类蛋白互作信息构建DEGs在蛋白层面互作关系，并在cytoscape中实现可视化(图1)。为了进一步深入揭示不稳定斑块发生发展机制，对该蛋白互作网络进行聚类分析并查找疾病相关风险模块。在不稳定斑块形成过程中，这些模块中差异基因可能发挥协同调控作用共同促进不稳定斑块发生。按模块中基因总数不少于5的阈值标准，本研究共获取了四个与不稳定斑块相关的风险模块(图2)，所有模块中互作基因差异表达方向均一致，同时，TYROBP、CXCR4、VCL和APOE分别是四个模块中的枢纽基因。

红色结点代表差异上调基因，蓝色结点代表差异下调基因 图2　蛋白互作网络中获取的4个模块

3讨论

本研究共获取了439个DEG，其中上调基因232个，下调基因207个，它们共同构成了老年患者不稳定斑块差异基因表达谱，与不稳定斑块的形成密切相关，从分子生物学角度再次证实稳定斑块发展为不稳定斑块是一个复杂的病理生理过程。GO和通路富集分析结果显示，炎症和免疫应答等相关生物学过程和通路被显著富集。

蛋白互作网络和模块分析结果显示 CXCR4、VCL和TYROBP在模块和蛋白互作网络中均处于中心位置，可能在促进斑块发生不稳定转化的病理过程中发挥着重要作用。CXCR4位于染色体2q21，属于G蛋白耦联趋化因子受体，可以与基质细胞衍生因子(SDF)-1发生特异性结合，参与趋化、细胞阻滞、血管生成和细胞生存等过程，促进HIV病毒转染宿主细胞、自身免疫性疾病发生和肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭〔12〕。Melchionna等〔13〕通过不同强度剪切应力处理人脐静脉内皮细胞发现低血流剪切力可以引起血管内皮损伤，损伤的血管内皮细胞较正常血管内皮细胞高表达CXCR4蛋白，从而诱导内皮细胞凋亡，研究者推测CXCR4可能参与早期动脉粥样硬化斑块形成，而下调CXCR4对血管起保护作用。国内研究人员通过使用冠心康干预小鼠主动脉粥样硬化进程发现，伴随主动脉粥样硬化程度减轻，冠心康组小鼠主动脉组织中SDF-1和CXCR4表达水平明显低于未干预组，研究者推测SDF-1/CXCR4轴可能是药物干预动脉粥样硬化进程的作用靶点〔14〕。de Gaetano等〔15〕研究表明，ApoE(-/-)小鼠上使用共轭亚油酸抑制CXCR4表达可以诱导早期动脉粥样斑块消退，降低斑块局部白细胞粘附能力和数量。与上述研究不同，Yao等〔16〕研究显示，在不稳定动脉粥样斑块模型鼠上，外源性静脉输注SDF-1通过激活SDF-1/CXCR4轴，募集保护性骨髓源性血管祖细胞，可诱导晚期不稳定斑块转归为稳定斑块。上述研究反映了CXCR4在动脉硬化发生发展过程中角色的复杂性和功能多样性，可能与不同研究中使用的动物模型(如小鼠遗传背景和造模方法差异)、斑块不同分期和血管祖细胞亚型差异有关。此外，通路富集分析结果显示该基因主要参与细胞因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作和白细胞跨膜迁移。CXCR4在本研究中差异上调，结合国内外相关研究认为该基因异常表达可能与不稳定斑块形成有关，需要进一步验证。VCL又称为黏着斑蛋白，位于染色体10q22.2，是一种细胞骨架蛋白，参与细胞-细胞或细胞-基质之间连接。Constantinescu等〔17〕研究发现，高血脂血清刺激鼠主动脉内皮细胞会引起VCL表达和分布发生异常改变，研究者推断VCL的异常变化可能促进动脉粥样硬化发生发展。另一项研究通过蛋白组学技术分析冠状动脉粥样硬化斑块和早期病变血管中膜组织中差异蛋白，发现VCL蛋白在斑块组织中表达下调，而后续免疫组化实验也证实了VCL表达水平的降低。研究者推断，在动脉粥样硬化进程中，VCL的表达异常促进动脉粥样硬化进展〔18〕。Rocchiccioli等〔19〕运用高效液相色谱法和质谱技术分析14对颈动脉斑块组织和斑块旁组织发现，与斑块旁组织相比，斑块组织低表达VCL蛋白，随后免疫组化和蛋白印迹证实VCL在斑块组织中表达下调，并推测VCL下调可能参与动脉硬化斑块发生发展。VCL富集到的通路主要是白细胞跨膜迁移和肌动蛋白细胞骨架调节。VCL在本研究中差异下调，其可能参与不稳定斑块形成，有待进一步实验验证。TYROBP，别名DAP12，位于染色体19q13.1，编码一种跨膜信号分子多肽，其编码的蛋白主要参与骨塑形、大脑髓鞘形成、信号传导和炎症反应〔20〕。值得一提的是，TYROBP基因在本研究中差异上调，但是其在动脉硬化斑块的表达情况尚未见报道，可能是不稳定斑块发生过程中新的诊断或预后相关基因，其差异验证和功能分析将是我们下一步研究的重点。

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〔2015-03-18修回〕

(编辑徐杰)