老年前列腺癌组织中Nedd4L对TrkA的泛素化调控

老年前列腺癌组织中Nedd4L对TrkA的泛素化调控

汪治宇郭晓金曹静

(河北医科大学第四医院肿瘤免疫科，河北石家庄050000)

摘要〔〕目的探讨神经前体细胞表达发育调控样蛋白(Nedd4L)通过泛素化降解癌蛋白神经生长因子酪氨酸激酶受体(TrkA)抑制老年前列腺癌的分子作用机制。方法收集手术切除的43例老年前列腺癌组织及对应癌旁组织标本。免疫组化染色检测Nedd4L及TrkA的表达，在人前列腺癌LNCaP细胞中转染Nedd4L特异性siRNA后，采用qRT-PCR及Western印迹检测LNCaP细胞内TrkA mRNA及蛋白的表达变化。结果Nedd4L蛋白在老年前列腺癌组织中表达明显降低，而TrkA表达显著升高(P<0.05)；二者呈显著负相关(P<0.05)，Nedd4L的表达降低与TrkA表达升高均与肿瘤淋巴结转移、高TNM分期显著相关(P<0.05)；在体外，下调Nedd4L表达后可显著升高TrkA蛋白的表达水平(P<0.05)，而对TrkA mRNA表达无明显影响(P>0.05)。结论Nedd4L及TrkA在老年前列腺癌组织中异常表达，Nedd4L可能通过泛素化降解癌蛋白TrkA实现其抗肿瘤作用。

关键词〔〕Nedd4L； TrkA；前列腺癌；泛素化

中图分类号〔〕R737.25〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81202037)

第一作者：汪治宇(1979-)，男，副主任医师，副教授，博士，主要从事肿瘤免疫学研究。

神经前体细胞表达发育调控样蛋白(Nedd4L)定位于人类染色体18q21.31上，是Nedd4家族中的一员，在脑、心脏、肺及肾脏等多种组织器官中都有表达〔1，2〕，作为一种HECT类E3泛素连接酶，它对EGFR、TGFβ及Wnt等多种蛋白及信号通路都有调节作用〔3~5〕，在黑色素瘤、非小细胞肺癌及胃癌等多种人类恶性肿瘤中表达下调或缺失，并与肿瘤恶性病理学特征及不良预后相关。神经生长因子酪氨酸激酶受体(Trk)A是神经生长因子(NGF)的高亲和力功能性受体。NGF与TrkA结合后能够在细胞膜上形成二聚体进而使TrkA胞内段的酪氨酸基因发生磷酸化，并活化下游Ras /PI3K/Akt 途径抑制凋亡蛋白的活化〔6〕。因而，TrkA在促进肿瘤增殖、侵袭转移及肿瘤耐药中具有关键作用。本课题通过体外转染实验探究Nedd4L在前列腺癌中的抗肿瘤作用及其分子机制。

1材料与方法

1.1材料本课题经我院伦理委员会审核批准后开展。收集2013年1月至2014年5月在我院泌尿外科行手术切除并经病理证实的前列腺癌及对应癌旁组织(距切缘>2 cm)标本43例，年龄62~79岁，中位年龄67岁。所有入组患者均签署知情同意文件，术前均未行放化疗。所有标本在切除后30 min内取材2份，分别置入40 g/L多聚甲醛溶液或液氮中保存。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(#1622)逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit(RR037A)Real time PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；Nedd4L引物(正义5′-ACAGT CTCATGTTTGATGCTTCGT-3′，反义：5′-AGAAGGCTGAAATGAA GCACGT-3′)，TrkA引物(正义 5′-ATCGT GAAGAGTGGT CTCCGTTT-3′，反义：5′-GAGAGAGACTCCAGAGCGTTGAA-3′)，GA PDH引物(正义：5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'，反义：5'-CT GTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3')由上海生工生物科技有限公司合成；人前列腺癌细胞系LNCaP购自中科院上海生物化学与细胞生物研究所；胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；1×DMEM液体细胞培养基购自美国Mediatech公司；Trizol试剂及脂质体2000(lipofectamineTM2000)购自美国Invitrogen公司；Nedd4L特异性siRNA及阴性对照(NC)siRNA、兔抗人Nedd4L多克隆抗体sc-85081、兔抗人TrkA多克隆抗体sc-20539及小鼠抗人β-actin单克隆抗体sc-47778均购自美国Santa Cruz公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所，ECL化学发光试剂盒购自Milipore公司。

1.2方法

1.2.1免疫组化检测前列腺癌组织中Nedd4L与TrkA的表达组织标本脱水、石蜡包埋后，自动切片机制作4 μm厚组织切片。切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡、水化后，于pH6.0枸橼酸缓冲液进行抗原热修复；3% H2O2水溶液阻断内源性过氧化物酶活性；10%山羊血清封闭后分别滴加兔抗人Nedd4L抗体(1∶100)及兔抗人TrkA抗体(1∶100)，4℃孵育过夜；洗去多余一抗后，加生物素标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min；洗去残余未结合二抗，滴加辣根过氧化物酶-链酶卵白素复合物进行反应，DAB显色、苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。每张切片由2位高年资病理医师，在高倍镜(×400)下随机选取10个视野，按以下标准〔7〕单独阅片、评分：染色强度评分：0分：阴性；1分：弱阳性；2分：中度阳性；3分：强阳性。阳性肿瘤细胞(或腺细胞)百分比评分：阳性细胞≤5% 为0分；6%~25% 为1分；26%~50% 为2分；51% ~75% 为3分；75% 为4分。每视野评分=染色强度评分×阳性肿瘤细胞(或腺细胞)百分比评分，取10个视野的平均得分作为最终评分。

1.2.2细胞培养LNCaP细胞株培养于含100 ml/L FBS的1×DMEM培养基中，37℃、50 ml/L CO2、饱和湿度下培养。稳定传代2~3代后，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.3细胞转染LNCaP细胞接种于6孔板中，采用含100 ml/L FBS的DMEM培养基培养细胞至汇合度达50%左右后，实验组每孔加入100 pmol/L Nedd4L特异性siRNA及5 μl LipofectamineTM2000；对照组每孔加入100 pmol/L NC siRNA及5 μl LipofectamineTM2000。每孔加入不含血清的DMEM培养基调整终体积至2 ml，置于37℃、50 ml/L CO2、饱和湿度下培养6 h后，更换完全培养基继续培养。

1.2.4qRT-PCR检测Nedd4L与TrkA mRNA的表达按TRIzol试剂说明书提取组织总RNA，按如下条件进行逆转录反应：70℃预变性5 min，37℃逆转录反应1 h，85℃反应5 min。取2 μl cDNA按Real-time PCR试剂说明书配制PCR体系，反应条件：95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火延伸30 s,扩增40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算Nedd4L与TrkA mRNA的相对表达量。每个样本独立重复实验3次。

1.2.5Western印迹法检测Nedd4L与TrkA蛋白的表达收集转染72 h后的LNCaP细胞，加入RIPA裂解液置冰上裂解10 min，裂解液收集于1.5 ml EP管中，4℃、14 000 r/min离心10 min后取上清。BCA法测定总蛋白浓度，每孔加入50 μg蛋白样品，100 g/L SDS-PAGE分离蛋白。采用BIO-RAD半干转印系统，20 V转膜1 h，50 g/L BSA室温封闭1.5 h；加入兔抗人Nedd4L抗体(1∶1 000)、兔抗人TrkA抗体(1∶1 000)及小鼠抗人β-actin抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜，0.01 mol/L TBST漂洗5 min×3次，分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h。0.01 mol/L TBST漂洗5 min×3次。于暗室内，在膜上滴加ECL溶液，并使胶片曝光，全自动洗片机洗片。

2结果

2.1Nedd4L及TrkA蛋白在前列腺癌及对应癌旁组织中的表达肿瘤组织中Nedd4L的阳性表达率为25.58%(11/43)，TrkA的阳性表达率为72.09%(31/43)。但在对应癌旁组织中Nedd4L阳性表达率达67.44%(29/43)，TrkA阳性表达率仅为16.28%(7/43)。Pearsonχ2检验显示，Nedd4L及TrkA在癌组织与正常组织中表达水平有显著性差异(P<0.001)。见图1。

图1　Nedd4L及TrkA蛋白在前列腺癌及癌旁组织中 阳性表达(×400)

2.2Nedd4L及TrkA蛋白表达与前列腺癌临床病理特征的相关性分析肿瘤组织中 Nedd4L蛋白的阴性表达及TrkA蛋白的阳性表达均与肿瘤淋巴结转移及高TNM分期呈正相关(P<0.05)，见表1。

表1Nedd4L及TrkA表达与前列腺癌患者临床病理特征的关系(n)

项目nNedd4L阴性表达χ2值P值TrkA阳性表达χ2值P值良性前列腺增生 有26190.9510.329211.4910.222 无171010总前列腺特异性抗原 ≤10ng/ml11102.4100.12161.2420.265 >10ng/ml321925病理分级 G1~G220162.6860.101122.7180.099 G3231319淋巴结转移 有27226.5140.027234.5570.033 无1678TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期21107.3450.007124.5600.033 Ⅲ+Ⅳ期221919

2.3Nedd4L及TrkA蛋白在前列腺癌组织中表达的相关性分析Spearman相关性分析证实二者表达呈显著负相关关系(r=-0.834,P<0.05)。

2.4Nedd4L siRNA转染人前列腺癌LNCaP细胞将Nedd4L特异性siRNA瞬时转染入人前列腺癌LNCaP细胞中，采用qRT-PCR及Western印迹检测Nedd4L siRNA的干扰效果，结果显示Nedd4L siRNA组Nedd4L mRNA及蛋白的表达水平均显著低于阴性对照(NC)组(P<0.05，图2)。

图2　不同siRNA转染LNCaP细胞后Nedd4L及 TrkA蛋白表达

2.5敲低Nedd4L对TrkA表达的影响敲低Nedd4L 表达后TrkA mRNA的表达水平较NC组无明显改变(1.000 vs 0.901±0.006，P>0.05)，而TrkA蛋白质的表达水平则显著下降(P<0.05，图2)。

3讨论

目前，根治性手术及术后规范放、化疗是治疗前列腺癌的主要方法〔8〕，但前列腺癌早期诊断困难、易发生骨转移等原因常导致患者就诊时已失去根治性手术机会。近年来，以阿比特龙(abiraterone)为代表的内分泌治疗及以伊匹单抗(ipilimumab)和德尼单抗(Dnosumab)为代表的分子靶向治疗在前列腺癌的治疗中显现出一定优势。

近年来，许多学者都进行了Nedd4L及TrkA与肿瘤的相关性研究。Tanksley等〔9〕在结肠癌中的研究发现，Nedd4L的mRNA及蛋白水平在各分期的结肠癌组织中均较正常结肠组织显著降低，并与患者不良预后显著相关；在体外，过表达Nedd4L可明显抑制结肠癌细胞中Wnt信号通路的活化。对大样本的检测发现，在肾上腺癌、胰腺癌、卵巢癌及膀胱癌等人类恶性肿瘤中均存在TrkA的表达上调。在体外，利用药物降低TrkA的表达后可显著抑制神经母细胞瘤IMR-32细胞的侵袭能力及裸鼠皮下成瘤体积。本研究提示Nedd4L与TrkA的异常表达可能在前列腺癌增殖和转移的生物学过程中发挥重要作用。

细胞内蛋白质的降解主要包括溶酶体途径及泛素化途径，其中，泛素途径是通过泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)及泛素连接酶(E3)一系列级联反应后，蛋白与多个泛素分子共价结合后被蛋白酶体复合物识别并降解，释放出来的泛素分子可循环使用。本研究结果提示Nedd4L可能对TrkA的表达存在调控作用。在神经细胞中的研究发现，Nedd4L能够通过泛素化修饰作用降解PC12细胞中的TrkA蛋白，削弱NGF与TrkA结合，进而影响PLCγ与 ERK1/2、MAPK信号通路的活化。作为一种E3泛素连接酶，Nedd4L可能通过泛素化作用降解细胞内TrkA蛋白。根据本文结果推断，在前列腺癌中Nedd4L通过泛素化途径在蛋白质层面对TrkA实现调控作用。

综上所述，Nedd4L与TrkA在前列腺癌中存在异常高表达，其表达水平与肿瘤恶性临床病理学特征显著相关。Nedd4L可能通过泛素化降解癌蛋白TrkA，在蛋白质层面发挥其抗肿瘤作用。

4参考文献

1巩传凤,刘畅,王岚,等.老年中晚期前列腺癌同期调强放疗联合内分泌治疗的疗效〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(10):2744-5.

2Dahlberg J,Melander O.Genetic variation in NEDD4L,salt sensitivity,and hypertension:human NEDD4L rs4149601 G allele generates evolutionary new isoform I with C2 domain〔J〕.J Hypertens,2014;32(9):1905-6.

3Kito Y,Bai J,Goto N,etal.Pathobiological properties of the ubiquitin ligase Nedd4L in melanoma〔J〕.Int J Exp Pathol,2014;95(1):24-8.

4Sakashita H,Inoue H,Akamine S,etal.Identification of the NEDD4L gene as a prognostic marker by integrated microarray analysis of copy number and gene expression profiling in non-small cell lung cancer〔J〕.Ann Surg Oncol,2013;21(Suppl 3):S590-8.

5Gao C,Pang L,Ren C,etal.Decreased expression of Nedd4L correlates with poor prognosis in gastric cancer patient〔J〕.Med Oncol,2012;29(3):1733-8.

6Kim MS,Shutov LP,Gnanasekaran A,etal.Nerve growth factor (NGF) regulates activity of the transcription factor NFAT in neurons via the phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K)-akt-glycogen synthase kinase 3β(GSK3β) pathway〔J〕.J Biol Chem,2014;289(45):31349-60.

7Li C,Yang W,Zhang J,etal.SREBP-1 has a prognostic role and contributes to invasion and metastasis in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Mol Sci,2014;15(5):7124-38.

8杨裕华,王际莘,贺法宪.前列腺癌二级预防研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(4):722-5.

9Tanksley JP,Chen X,Coffey RJ.NEDD4L is downregulated in colorectal cancer and inhibits canonical WNT signaling〔J〕.PLoS One,2013;8(11):e81514.

〔2013-12-09修回〕

(编辑李相军)