D-IBS 与FD 重叠征大鼠精神状态、胃肠激素水平改变

全 俊，严 晋，丁 懿，陈 磊，陈齐鸣，朱海杭，张旭东，卜 平

扬州大学临床医学院1.消化病研究室;2.病理实验室，江苏 扬州225001;3.泰兴人民医院中医科

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是目前最常见的功能性胃肠道疾病之一，据报道，1/3 ～2/3 IBS 患者具有与功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)相重叠的症状［1］。IBS 与FD 重叠的发病机制尚未完全阐明，普遍认为其与精神心理异常及脑肠轴功能紊乱有关，症状重叠提示两者可能具有共同的神经胃肠病学基础［2］。目前对于IBS 重叠FD 大鼠模型胃肠激素水平与行为学因素关系的研究鲜有报道。因此，本研究在完成D-IBS 重叠FD 动物模型的基础上［3］，对D-IBS 重叠FD 模型大鼠神经-免疫-内分泌失调机制进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物:SPF 级雄性Wistar 大鼠50 只，体质量(220 ±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK(京)2012-0001。

1.1. 2 药物:药物大黄(批号:20120701，产地:甘肃)。大黄煎煮液制备:称取1 000 g 大黄药材，粉碎成粉末，加入1 800 ml 水浸泡5 h，煎煮8 min，定容至1 000 ml，即得1 g/ml 的大黄煎煮液，置4 ℃冰箱中保存备用［4］。

1. 1. 3 主要试剂与仪器:5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)、生长抑素(somatostatin，SS)、血管活性肠肽(vasoactine intrestinal peptide，VIP)、内毒素(endotoxin，ET)及白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所，兔抗白细胞介素-2(interlenkin-2，IL-2)、免疫组化染色试剂盒及DBA 染色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。酶标仪为美国伯乐公司bio-680 型。旷场视频分析系统(Open-Field 行为学观察)购自上海软隆科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组:50 只雄性Wistar 大鼠，适应性饲养7 d，按随机数字表法将大鼠分为正常对照组(A 组)，不处理;造模B 组，采用先FD 后D-IBS 造模法(先夹尾后大黄灌胃，FD +D-IBS);造模C 组，单纯FD 造模(单纯夹尾造模法);造模D 组，单纯D-IBS 造模(单纯大黄灌胃法);造模E 组，先D-IBS 后FD 造模法(先大黄灌胃后夹尾造模法，D-IBS+FD);每组10 只，每笼5只。于室温(22 ±2)℃、相对湿度保持50% ～60%、光照节律12L∶12D(6∶00 ～18∶00)、噪音＜50 dB 的环境中饲养，正常摄食饮水。

1.2.2 动物模型的建立:A 组在正常条件下饲养。B组先参考郭氏夹尾刺激法［5］，建立FD 模型，用尖端包裹纱布的大弯止血钳夹大鼠尾巴远端1/3 处，大鼠暴怒，令其与其他大鼠撕打，间接激怒全笼大鼠，每次刺激30 min，30 min 内连续不断地刺激，3 次/d，以不破皮流血为度，持续刺激7 d。大鼠受伤后用聚维酮碘消毒液涂擦损伤部位预防感染干扰实验结果。造模第8天，开始用大黄煎煮液(1 g/ml)灌胃，2 ml/只，2 次/d，连续灌胃14 d，建立D-IBS 模型［4］。灌胃时继续夹尾刺激，频次改为2 次/d，每次15 min。C 组夹尾刺激法14 d，D 组大黄煎煮液灌胃14 d，E 组先大黄煎煮液(1 g/ml)灌胃7 d，第8 天在灌胃的同时，进行夹尾刺激，每次刺激30 min，3 次/d，持续刺激7 d。

1.2.3 实验方法:造模结束，禁食禁水24 h，2%葡聚糖蓝2 000 溶液0.4 ml/只灌胃，30 min 后5%水合氯醛腹腔麻醉。开腹肝门静脉取血装于乙二胺四乙酸二钾(ethylene diamine tetraacetie acid-K2，EDTA-K2)抗凝管中，3 000 r/min 离心15 min，离心半径11 cm，取血浆分装后于-80 ℃冰箱冻存待测。并取胃和结肠。

1.2.4 进食量的测定:采用进食量差值测定法。每组动物每日上午8∶00 给定量的大鼠饲料，至次日上午8∶00测量剩余量，两者的差值与大鼠数目的比值，即为每只大鼠的每日进食量。

1.2.5 糖水消耗实验:采用糖水消耗百分比测定法。适应性饲养期间训练大鼠喝糖水，第1 天给予两瓶1%(1 g/100 ml)的蔗糖水溶液，第2 天开始每笼左右次序随机的糖水、蒸馏水各一瓶，直至造模前1 d(下午2∶00)开始每7 d 进行一次糖水消耗实验，评估大鼠对奖励的敏感性。测糖水消耗前1 d 禁食禁水21 h 后每笼给予每组大鼠1 瓶1%(1 g/100 ml)的蔗糖水溶液和1 瓶蒸馏水，然后测定各组大鼠在120 min 后的蔗糖水溶液和蒸馏水的饮用量，计算糖水消耗百分比率。糖水消耗实验是客观观察大鼠对于奖赏的反应，糖水消耗百分比降低提示大鼠对幸福事件反映能力降低，这是一种特异性的快感缺乏，代表大鼠的抑郁精神状态。

1.2.6 大鼠胃排空测定:大鼠取血和组织后，自幽门括约肌处取胃，沿大弯侧剪开，将胃内残留色素充分溶于10 ml 蒸馏水中，超声15 min，3 000 r/min 离心15 min，取上清液，620 nm 测吸光度，求出与A 组均值的百分比，即胃内色素相对残留率，相对残留率越低，胃排空越强。

1.2. 7 旷场实验:实验用长× 宽× 高为50 cm ×50 cm×40 cm 的旷场箱，内侧壁及底面为黑色，旷场箱正上方安置摄像头。参考文献［6］，于造模前1 d 及造模后，在安静无干扰并杜绝参照物的环境条件下进行。实验前先将大鼠置于测试室内适应10 min。握住大鼠尾根部1/3 处，轻轻将大鼠放入旷场箱的正中，开始同步录像、计时。观察3 min 内大鼠活动情况，进行行为学分析。旷场实验可以客观评价大鼠行为学变化，平均速度的减少反映大鼠处于焦虑状态［7］。参照文献［8］，旷场实验可以客观评价大鼠行为学变化，平均速度的减少反映大鼠处于焦虑状态。

1.2.8 血液及肠组织相关指标检测:取-80 ℃保存的血浆复融后，混匀，3 000 r/min 离心15 min，取上清液测定。采用ELISA 法检测，并按照说明书要求严格操作测定血浆5-HT、SS、VIP、ET 及IL-10。采用DAB免疫组织化学染色法检测大鼠肠组织中IL-2 表达情况。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件及EXCEL 软件进行处理，描述性资料用±s 表示，组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，两两比较采用q 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义，P ＜0.01 为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠的行为学观察 整个造模过程中，A 组大鼠的一般外观行为等无异常。与A 组相比，随着造模天数的增加，模型组(B、C、D、E)大鼠的行为状态均由正常逐渐变得少动、扎堆、弓背、不活跃;背毛由顺滑、光泽变得枯黄、蓬乱、没有光泽;睡眠逐渐变得易醒、倦卧;B 组情绪由正常变得易怒，继而淡漠，对外界刺激兴奋性低，C 组情绪由正常变得易怒，D、E 组情绪由正常变得淡漠，对外界刺激兴奋性低;B、D、E 均出现大便不成形;在造模的第2 天大鼠进食量减少，第3 天大鼠体质量增长减缓。造模14 d 后各模型组大鼠体质量增长显著下降(P ＜0.01，见表1)。

表1 5 组大鼠体质量及日均进食量比较(g，±s)Tab 1 Comparison of the average daily food intake and quality of 5 groups rats (g，±s)

表1 5 组大鼠体质量及日均进食量比较(g，±s)Tab 1 Comparison of the average daily food intake and quality of 5 groups rats (g，±s)

注:与A 组比较，＊＊P ＜0.01，* P ＜0.05。

分组 例数 体质量增长 日均进食量A 组10 73.1 ±7.9 31.5 ±0.7 B 组 10 35.3 ±9.5＊＊ 20.3 ±1.1*C 组 10 45.0 ±6.1＊＊ 23.1 ±1.6*D 组 10 3.9 ±12.4＊＊ 19.8 ±0.5*E 组 10 -2.5 ±12.1＊＊ 19.5 ±0.5*

2.2 大鼠胃排空的测定 与A 组(100.0 ±13.1)%比较，B 组(144.1 ±17.2)%、C 组(168.0 ±20.0)%大鼠胃内色素相对残留率显著增大(P ＜0. 05)，D 组(39.0 ±12.4)%显著降低(P ＜0.01)，E 组(105.3 ±12.3)%变化差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.3 大鼠解剖结构的观察 解剖各组大鼠后肉眼观察胃及肠组织，未见溃疡及色泽形态改变。造模后B组大鼠体质量增长幅度显著下降、进食量显著减少，且造模过程中一直有稀便;肉眼观察胃肠解剖结构未见异常。与文献［3］描述相一致，说明B 组D-IBS 与FD重叠征模型建立成功，剔除E 组。

2.4 造模对大鼠糖水消耗的影响 与A 组(83.4 ±13.6)%比较，B 组(63. 4 ± 9. 3)% 显著降低(P ＞0.01)，C 组(74.4 ±7.5)%大鼠糖水消耗百分比显著降低(P ＜0.05)，D 组(78.2 ±5.3)%差异变化无统计学意义(P ＞0.05)。

2.5 大鼠旷场内平均速度 与A 组(1.49 ±0.28)%比较，B 组(1.09 ±0.22)%、E 组(0.82 ±0.21)%大鼠旷场内平均活动速度显著降低(P ＜0. 05)，C 组(1.53 ±0.40)%变化差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.6 大鼠血浆中脑肠肽、细胞因子测定 与A 组比较，B 组大鼠血浆5-HT 水平降低，但差异无统计学意义(P ＞0. 05);C 组大鼠血浆IL-10 水平显著升高(P ＜0.01);与A 组、B 组比较，D 组大鼠血浆ET 水平显著降低(P ＜0.05);B 组、D 组大鼠血浆SS 水平显著降低(P ＜0. 01);B、D 组大鼠VIP 水平显著升高(P ＜0.01，见表2)。

表2 大鼠血浆中脑肠肽、细胞因子检测结果(±s)Tab 2 Detection results of ghrelin and cytokines in the rats plasma (±s)

表2 大鼠血浆中脑肠肽、细胞因子检测结果(±s)Tab 2 Detection results of ghrelin and cytokines in the rats plasma (±s)

注:与A 组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。与B 组比较，△P ＜0.05。

分组 例数 5-HT(pg/ml) IL-10(ng/L) ET(Eu/L) SS(μg/L) VIP(ng/L)A 组 10 145.92 ±21.03 42.31 ±6.16 0.58 ±0.09 10.75 ±0.59 284.40 ±37.37 B 组 10 136.66 ±28.81 43.71 ±4.16 0.65 ±0.13 8.40 ±2.53＊＊ 406.87 ±67.15＊＊C 组 10 149.51 ±34.40 53.90 ±7.68＊＊ 0.59 ±0.13 9.74 ±1.01 314.46 ±63.46 D 组 10 153.23 ±27.57 45.35 ±5.50 0.47 ±0.03＊△ 6.33 ±1.46＊＊ 439.23 ±52.65＊＊

2.7 大鼠结肠组织IL-2 阳性细胞百分比测定 与A组比较，模型组结肠组织IL-2 主要表达在胞质内(见图1)。与A 组IL-2 阳性细胞(54.9 ±8.3)%比较，C组(43.7 ±4.1)%、D 组(45.4 ±5.2)%显著减少(P ＜0.01);B 组(54.0 ±7.5)%变化差异无统计学意义(P ＞0.05)。

图1 大鼠结肠组织IL-2 阳性细胞百分比(400 ×) A:A 组;B:B 组;C:C 组;D:D 组Fig 1 IL-2 positive cell percentage of colonic tissue in rats A:A group;B:B group;C:C group;D:D group

3 讨论

IBS 特别是腹泻型IBS 与FD 是两种临床常见性胃肠病。IBS 和FD 临床上易发生重叠，内脏高敏感性及胃肠动力功能失调可能是其共同的发病机制，此外还包括社会心理等影响。代子艳等［8］研究发现，IBS重叠FD 患者比单纯IBS 或FD 患者合并焦虑、抑郁的比例更高，胃肠道症状更严重。本研究采用“夹尾刺激+大黄灌胃”方法构建D-IBS 与FD 重叠大鼠模型，与A 组比较，造模后大鼠出现弓背、背毛枯黄、稀大便、易怒等症状，测体质量增长显著降低，胃排空延迟明显，与D-IBS 与FD 重叠患者腹痛、腹泻、精神异常、胃排空延迟相一致。

本研究中，与A 组比较，B 组、C 组大鼠糖水消耗百分比显著降低，D 组无明显变化，推测D-IBS 与FD重叠造模大鼠较单纯D-IBS 及FD 造模大鼠更为抑郁。大鼠旷场实验，已被广泛用于神经学与精神药理学研究中［7］。本研究中，与A 组比较，B、D 组大鼠旷场内平均速度显著下降，而C 组无明显变化，说明重叠征造模大鼠及单纯D-IBS 造模大鼠活跃度下降。结合糖水消耗实验结果推测D-IBS 与FD 重叠造模大鼠精神症状更为严重。

首先，5-HT 作为神经递质，主要分布于松果体和下丘脑，参与痛觉、睡眠和体温等生理功能的调节，与胃肠道活动关系密切。研究发现，在注射相同剂量5-HT 时，伤害感受，表明外周5-HT 水平与内脏高敏感性有密切关系［9］。5-HT 是一种能产生愉悦情绪的信使，5-HT 水平较低的人群更容易发生抑郁、冲动、酗酒、自杀、攻击及暴力行为。本身为一类抗抑郁药［10］，可减少患者对酒的渴求程度，减少饮酒量［11］。本研究中，与A 组比较，D 组大鼠血浆中5-HT 水平有升高趋势;B 组大鼠有降低趋势。考虑本研究中D-IBS 与FD重叠造模组大鼠同时存在抑郁和肠道高敏感这两种导致5-HT 水平相反的状态，故大鼠血浆中5-HT 水平无统计学意义。

其次，SS 广泛存在于胃肠道黏膜的D 细胞，以胃窦和胃体最高，在肠内越往下含量越低。SS 通过旁分泌机制由突起释放到G 细胞和壁细胞膜上，抑制胃泌素和HCl 分泌，在胰腺内，SS 由胰岛D 细胞分泌，通过血液循环对胃肠运动与消化道激素的分泌产生抑制作用。SS 水平降低可导致胃泌素分泌过多及胃肠蠕动增强;胃泌素促进胃窦、胃体收缩，增加胃肠道的运动，同时促进幽门括约肌收缩;整体综合作用是使胃排空减慢［12］。本研究中，与A 组比较，D-IBS 与FD 重叠造模组大鼠血SS 显著降低，推测D-IBS 与FD 重叠造模组大鼠胃排空延迟及肠蠕动增强与血浆SS 水平降低有关。

再次，VIP 是神经递质的一种，存在于中枢神经和肠神经系统中。食管下括约肌的舒张则是由迷走神经纤维末梢释放的VIP 介导的，VIP 又通过促进靶细胞合成NO 而使平滑肌舒张。对肠液的分泌具有很强的促进作用，对胃液的分泌可起抑制作用，对消化道平滑肌的收缩产生抑制作用［13］。本研究中，与A 组比较，具有腹泻症状的B、D 组血浆VIP 水平显著升高，推测D-IBS 与FD 重叠造模组大鼠腹泻症状与血浆VIP 水平升高有关。

此外，ET 是革兰氏阴性菌菌体中存在的毒性物质的总称，是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释出。肠道菌群多为革兰氏阴性菌，如乳酸杆菌，当与宿主处于生态平衡状态，它们并不引起机体的感染，但是，在特定条件下，因为菌群失调、宿主免疫功能低下或菌群寄居部位改变造成了生态失调状态，正常菌群也能引起感染。大肠杆菌产生分泌到它们细胞外面的肠毒素能引起患者腹泻［14］;造模用大黄具有广谱抗菌作用［15］，故与A 组比较，较单纯大黄灌胃的D 组大鼠血浆ET 水平显著降低，而与D 组比较，“夹尾刺激+大黄灌胃”的B 组大鼠血浆内ET 水平显著升高，推测D-IBS 与FD 重叠造模组大鼠存在肠道菌群紊乱，释放ET 导致腹泻症状。

最后，IL-10 是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。有很多观察描述了IL-10 在各种疾病的发病机理中有很重要的作用，并分为两个亚型:IL-10 表达过多疾病，IL-10 表达绝对或相对减少引起疾病，IL-10 表达过多会引起免疫抑制作用［16］。本研究中，与A 组比较，D 组大鼠血浆IL-10水平显著升高，B 组变化差异无统计学意义，推测FD大鼠免疫力下降，重叠征模型大鼠免疫力正常。

IL-2 是白细胞介素中的一种。它由多细胞来源(主要由活化T 细胞产生)，又具有多向性作用的细胞因子(主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化)。它对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，可提高人体对病毒、细菌、真菌、原虫等感染的免疫应答，使细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)、天然杀伤细胞(NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖，并使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等［17］。IL-2 水平降低与年龄的增长及免疫缺陷病有关。本研究中，与A 组比较，C、D组大鼠肠组织中IL-2 表达阳性细胞显著减少，B 组大鼠肠组织中IL-2 表达阳性细胞数变化差异无统计学意义，推测单纯FD 与单纯D-IBS 模型大鼠存在免疫应答和抗病毒感染能力下降，D-IBS 与FD 重叠造模组大鼠无免疫应答和抗病毒感染能力变化。

本研究通过建立D-IBS 与FD 重叠征大鼠模型，观察大鼠抑郁程度、活跃度，测定大鼠血浆和组织中神经-内分泌-免疫相关脑肠肽细胞因子水平变化。研究发现，较正常对照组及单纯D-IBS 和单纯FD 造模组比较，D-IBS 与FD 重叠征大鼠模型更为抑郁、活跃度更低、生长抑素降低、血管活性肠肽水平升高、血浆内毒素水平升高，免疫功能无明显异常。

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