新型肽对Lewis肿瘤细胞的作用

新型肽对Lewis肿瘤细胞的作用

王溪原史育萌1钱鑫1匡野2赵志涛王毅周庆伟

(中国医科大学附属第四医院，辽宁沈阳110032)

摘要〔〕目的探讨新型肽对Lewis肿瘤细胞的抑制作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测Lewis肿瘤细胞在不同时间段(24、48、72 h)细胞增殖活性，构建C57BL/6N纯系小鼠肺癌模型，免疫组化法检测细胞周期蛋白D1阳性表达。结果Lewis肿瘤细胞在给药48 h，新型肽对肿瘤细胞的增殖具有明显抑制作用，与空白对照组比较差异显著(P<0.05)；在连续给药21 d后，肿瘤体积明显缩小，抑制率为43.38%；细胞周期蛋白D1阳性表达明显降低，与空白对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。结论新型肽可能通过调节细胞周期蛋白D1的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤生长作用。

关键词〔〕新型肽；细胞增殖；肺肿瘤；细胞周期蛋白D1

中图分类号〔〕R73〔

通讯作者：周庆伟(1959-)，男，博士，主要从事药理学研究。

1长春中医药大学附属医院2吉林大学药学院

第一作者：王溪原(1969-)，男，博士，副教授，主要从事临床医学研究。

目前临床上以手术、放射治疗和化疗为肺癌的主要治疗手段〔1〕。迄今国内外已研究的抗肿瘤药物众多，但多数价格昂贵且不良反应大，同时也存在耐药性问题，使其临床应用受到一定限制〔2，3〕。为此，寻找高效、低毒、价廉且能有效提高疗效的药物治疗肺肿瘤是亟需解决的问题。本实验旨在研究一种新型肽对Lewis肿瘤细胞增殖的抑制作用，并通过抑瘤实验及细胞周期蛋白(Cyclin)D1的表达，初步探讨其抑制肿瘤细胞可能的作用机制，为研究新型肽治疗肺肿瘤提供新的理论依据。

1材料与方法

1.1细胞、主要试剂及药品Lewis肺癌细胞株：购自中国科学院上海细胞生物学研究所。主要试剂：①细胞周期检测试剂盒(产品编号：C1052)，江苏碧云天生物技术研究所产品；②二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均为美国Sigma 公司产品；③新型肽由上海吉尔公司合成，纯度为98%；④博来霉素由浙江海正药业股份有限公司提供(批号：H20055883)。

1.2主要仪器①显微镜(日本尼康公司)；②二氧化碳培养箱 (日本三洋电机株式会社制造，产品型号：NCO-15AC)；③AN YANG超净台(中国苏州安洋科技发展有限公司,型号：BSC-BOOⅡB2)；④流式细胞仪(美国becton-Dickson公司)；⑤酶标仪(上海BIO-RAD公司，MODEL550型)。

1.3方法

1.3.1MTT法检测细胞存活率取对数生长期Lewis肿瘤细胞，常规胰酶消化，制成单细胞悬液并计数，以每孔1×104/ml接种于96孔板中，100 μl/孔，终体积为200 μl，37℃、5%CO2培养4 h，待细胞贴壁后，随机分为空白对照组、博来霉素组及不同浓度新型肽(450 μg/ml、900 μg/ml及1 800 μg/ml)组，20 μl/孔，空白对照组加入等体积的培养液，每组分别设5个复孔。置入37℃、5%CO2培养，分别孵育24、48、72 h，每孔加入20 μl MTT孵育4 h，以DMSO每孔150 μl终止反应。将96孔板移入平板振荡器，水平振荡10 min。用酶联免疫检测仪于490 nm波长测定吸光度(A)值，以空白对照孔A值调零，记录结果。

1.3.2肺肿瘤模型的建立选用6周龄的C57BL/6N纯系小鼠共计30只，体重18～22 g，每鼠在左腹股沟皮下接种0.2 ml Lewis肿瘤细胞(细胞数为1×107/ml)，随机分为模型组、博来霉素组及新型肽组，每组10只，博来霉素组腹腔注射1.04 mg/kg，新型肽组腹腔注射24 mg/kg，模型组注射同体积的生理盐水。接种瘤细胞后第2天开始给药，1次/d，连续21 d，末次给药后24 h处死小鼠，取瘤块并称重，计算抑瘤率。

1.3.3免疫组织化学法检测①肿瘤组织取材，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片(4 μm)，组织切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；②抗原修复，将切片侵入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，微波炉加热至拂腾，冷却后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗；③灭活内源性氧化物酶：30%H2O2一份+蒸馏水九份混合，室温5～10 min，以灭活内源性酶；④正常血清封闭液(5%BSA封闭液)室温20 min；⑤ 滴加一抗(Cyclin D1，1∶300稀释)，湿盒中4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗；⑥ 滴加小鼠生物素二抗，37℃孵育20 min；PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记链亲和素，37℃下孵育20 min，PBS冲洗；⑦滴加二氨基联苯胺(DAB)显色液，室温显色，光镜下控制反应时间，蒸馏水冲洗；⑧ 苏木素复染，5～10 s，自来水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片后，镜下观察。拍照。

2结果

2.1MTT法检测细胞活性不同剂量新型肽作用Lewis肺癌细胞，在24 h时，各实验组之间抑制作用无显著性差异(P>0.05)。在48 h时，新型肽对Lewis细胞具有明显的抑制作用，新型肽组与空白对照组比较差异显著(P<0.05)，在72 h时，博来霉素组与新型肽不同剂量组之间比较无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1　新型肽对Lewis肿瘤细胞活性

与空白对照组比较：1)P<0.05

2.2新型肽对C57BL/6N纯系小鼠肿瘤抑制作用的影响新型肽在连续给药21 d、剂量为24 mg/kg时对C57BL/6N小鼠肿瘤具有明显抑制作用，其抑制率为43.38%，与模型组比较具有统计学意义(P<0.05)，新型肽组与博来霉素组比较无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2　新型肽对C57BL/6N纯系小鼠肿瘤的

与模型组比较:1)P<0.05

2.3新型肽对Cyclin D1表达的影响模型组阳性细胞数量显著多，阳性信号表达较强，呈深棕黄色，新型肽组Cyclin D1阳性细胞(42.26±3.36)明显较少,与模型组(55.50±4.87)比较差异显著(P<0.05)，博来霉素组Cyclin D1阳性细胞数量(43.51±3.96)也明显减少，且阳性细胞的信号表达较弱，与模型组比较差异显著(P<0.05)。

3讨论

肺癌是全球普遍发生的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居恶性肿瘤之首。由于该疾病的发病机制目前仍不清楚，其治疗一直没有重大突破。传统治疗主要通过手术，并联合化疗、放疗减少肿瘤的复发及转移，但其治愈率仍较低，至今尚无突破性进展，故肺肿瘤的有效治疗手段仍是临床研究的热点。

肿瘤的发生是多途径、多步骤的，还与细胞凋亡有关，细胞增殖与凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生、发展密切相关。因此，抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段之一〔4，5〕。有研究表明〔6〕，细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、CDK4、Rb参与细胞周期G1/S期的转换，Cyclin D1、CDK4 表达异常及 Rb 蛋白的磷酸化状态与多种恶性肿瘤的发生和发展有关。细胞周期调控蛋白Cyclin D1通过激活CDK4，介导Rb蛋白的磷酸化使得细胞越过调控点，进入S期，细胞过度增殖而导致肿瘤的发生。本研究提示新型肽对肿瘤细胞的抑制作用可能通过下调靶基因Cyclin D1蛋白的表达抑制细胞 DNA 的合成，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

4参考文献

1Genova C，Rijavec E，Barletta G,etal.Afatinib for the treatment of advanced non-small-cell lung caner〔J〕.Exper Opin Pharmacother，2014;15(6):889-903.

2Okada M，Sato A，Shibuya K.JNK contributes to temozolomide resistance of stem-like glioblastoma cells via regulation of MGMT expression〔J〕.Int J Oncol，2014;44(2):591-9.

3Sze CI，Su WP，Chiang MF，etal.Assessing current therapeutic approaches to decode potential resistance mechanisms in glioblastomas〔J〕.Front Oncol，2013;3(1):59.

4方艳秋，齐亚灵，白晓，等.Survivin反义核苷酸对肝细胞株SMMC-7721增殖的影响〔J〕.吉林大学学报：医学版，2013;39(2):278-81.

5Bartuzi P，Hofker MH，van de Sluis B.Tuning NF-κB activity:a touch of COMMDD proteins〔J〕.Biochim Biophys Acta，2013;1832(12):2315-21.

6Chen B，Pan H，Zhu L,etal.Progesterone inhibits the estrogen-induced phosphoinositide 3-Kinase→AKT→GSK-3β→Cyclin D1→pRB pathway to block uterine epithelial cell proliferation〔J〕.Mol Endocrinol，2005;19(8):1978-90.

〔2013-12-09修回〕

(编辑袁左鸣)