CD147和VEGF—C在肺鳞癌、腺癌中的表达与临床意义

吴强　张祥海

[摘要]目的 本研究旨在探讨CDl47和VEGF-C在肺鳞癌、腺癌中的表达水平与临床病理之间的联系以及相互关系。方法运用免疫组化的方法对57例肺癌组织标本进行CDl47和VEGF-C检测。结果（1）57例肺鳞癌、腺癌中CDl47和VEGF-C的阳性表达率分别为63.16%、66.67%。肺鳞癌组和腺癌组CDl47和VEGF-C表达无差异（P>0.05）。（2）肺鳞癌、腺癌中CDl47和VEGF-C表达与肿瘤淋巴结转移有关（P<0.05）及肿瘤TNM分期有关（P<0.01），而与患者的年龄、性别、吸烟及肿瘤细胞分化程度无关（P>0.05）。（3）CDl47与VEGF—C的表达呈正相关（x2=12.214，P<0.01）。结论 CD147和VEGF-C在肺鳞癌、腺癌的浸润进展和转移过程中起重要作用，而且可能发挥协同作用。CD147和VEGF-C可作为判断肺癌患者预后的有用指标。

[关键词]肺肿瘤；免疫组化；CD147；VEGF-C

[中图分类号]R734.2 [文献标识码]B [文章编号]2095-0616（2016）06-156-05

CDl47是一种广泛分布于人体多种组织细胞表面的跨膜糖蛋白，又名为细胞外基质金属酶诱导蛋白（EMMPRN），属于免疫球蛋白家族（IgSF）成员。它在多种肿瘤细胞中高表达，刺激肿瘤中的成纤维细胞分泌基质蛋白酶类（MMPs），参与细胞外基质和基底膜降解，在肿瘤浸润、转移过程中起重要作用。VEGF-C是VEGF家族成员，具有刺激血管和淋巴管生成的双重作用，VEGF-C的高表达可以促进肿瘤淋巴管的生成及肿瘤细胞向区域淋巴结转移。本研究采用免疫组织化学方法，检测57例非小细胞肺癌（NSCLC）组织中CDl47和VEGF-C的表达情况，探讨其与肺癌组织的组织学类型、分化程度、临床分期、淋巴结转移等临床病理特征之间的关系及二者的相关性。

1.材料与方法

1.1病理标本

收集三峡大学第一临床医学院（宜昌市中心人民医院）胸心外科2003年7月-2007年4月手术切除且术前未经放化疗的原发性肺鳞癌、腺癌组织标本57例。所有标本均常规取材，甲醛固定，常规石蜡包埋，厚度5um连续切片。分别做HE和免疫组化染色。

1.2临床与病理资料

本组共57例患者均经临床病理确诊，术前均未经放疗或化疗治疗，其中男46例，女11例；年龄28～71岁，平均57.3岁，鳞癌46例，腺癌11例；手术切除淋巴结病理证实有淋巴结转移者29例，病理分级：高分化16例，中分化24例，低分化17例。按照国际抗癌联盟（UICC）2002年颁布的第6版国际肺癌TNM分期标准进行分期，I（Ia+Ib）期13例，Ⅱ期（Ⅱa+Ⅱb）26例，Ⅲ（Ⅲa+Ⅲb）期13例，Ⅳ期5例，吸烟（吸烟指数>400）34例。

1.3试剂

兔抗人CDl47多克隆抗体，兔抗人VEGF-C多克隆抗体及PV-9000二步法即用型试剂盒均从北京中杉金桥生物技术有限公司购买。

1.4方法

免疫组化染色采用PV-9000二步法，按照说明书操作步骤如下：（1）石蜡切片常规脱蜡、水化。（2）用3%H2O2去离子水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶。（3）根据一抗要求用微波加热抗原修复。（4）滴加一抗，湿盒中37℃两小时，PBS冲洗，2min×3次。（5）滴加试剂1，室温孵育20min，PBS冲洗2min×3次。（6）滴加试剂2，室温孵育30min，PBS冲洗2min×3次。（7）用DAB溶液显色。（8）苏木精复染后，脱水，透明，封片。用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性对照片作阳性对照。

1.5CD147和VEGF-C结果判定

CDl47以细胞膜和（或）细胞质呈黄色为阳性，VEGF-C阳性染色主要为细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片随机观察5个高倍视野（400倍），每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞数。CDl47综合染色强度和阳性染色细胞占癌细胞总数的比例进行判断。（1）按切片中细胞着色深浅评分：0分细胞无着色；1分为黄色；2分棕黄色；3分为棕褐色。（2）按阳性细胞数占癌细胞总数的比例评分：1分为<25%；2分为≥25%且≤50%；3分为>50%且≤75%；4分为>75%。取（1）、（2）两项的乘积为总积分：0～3分为阴性；>3分且≤6分为（+）；>6分且≤9分为（++）；>9分为（+++）。VEGF-C阳性强度判断标准：癌细胞，脉管内皮细胞质呈棕黄色为染色阳性细胞。肺癌细胞VEGF-C表达强度：按癌细胞免疫组化染色着色深浅计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。按阳性细胞所占百分比打分：阴性为0分、阳性细胞<10%为1分、阳性细胞数11%～50%为2分、阳性细胞数>51%为3分；染色强度与-阳性细胞分比的乘积：0～2分为，3～4分为+、5～7分++、8～9分+++。染色结果有两名病理医师采用双盲法评定，（-/+）为低表达，（++/+++）为高表达。

1.6统计学方法

应用SPSS13.0软件进行数据处理，计数资料采用x2检验和相关分析，并计算Pearson列联系数，P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1CDl47与VEGF-C在肺鳞癌、腺癌中的表达及与病理特征的关系

免疫组化染色CD147主要定位于肿瘤细胞膜和细胞质内，VEGF-C主要定位于肿瘤细胞的细胞质，均呈棕黄色或褐色小片状或颗粒状。在本组病例中CDl47与VEGF-C的阳性表达率分别为63.16%（36/57）、66.67%（38/57），CDl47在肺鳞癌、腺癌的阳性率分别为58.70%（27/46）、81.82%（9/11），VEGF-C在肺鳞癌、腺癌的阳性率分别为60.87%（28/46）、90.91%（10/11），二者在肺鳞癌、腺癌中的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。在不同的细胞分化程度之间CDl47和VEGF-C的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。CDl47和VEGF-C在有淋巴结转移组的阳性率分别为（24/29）82.76%、82.76%（24/29），显著高于无淋巴结转移组42.86%（12/28）、50.00%（14/28）（P<0.05）。见表1。

2.2CD147与VEGF-C在肺鳞癌、腺癌中的表达与临床特征的关系

CD147和VEGF-C在肺癌中的阳性表达与患者的年龄、性别及有无吸烟（吸烟指数>400）均无明显地相关性。在I+Ⅱ期组CDl47和VEGF-C的阳性率分别为48.72%（19/39）、53.85%（21/39）；在Ⅲ+Ⅳ期组分别为94.44%（17/18）、94.44%（17/18）。CDl47和VEGF-C在肺鳞癌、腺癌中的表达与肿瘤的临床分期有密切关系（P<0.01）。见表2。

2.3CD147和VEGF-C在肺鳞癌、腺癌中的表达的相互关系

57例患者中，36例CDl47阳性表达中同时有VEGF-C阳性表达30例；21例CDl47阴性患者中，有8例VEGF-C阳性表达。CDl47与VEGF-C的表达呈正相关（X2=12.214，P<0.01）。见表3。

3.讨论

肺癌与其他实体肿瘤一样具有侵袭和远处转移的生物学特性，而恶性肿瘤细胞的侵袭、转移是多因素参与的交联式多步骤反应的复杂过程。包括原发肿瘤浸润、基底膜降解、肿瘤细胞进出血管和肿瘤细胞对靶组织侵袭等环节。在这一复杂的过程中，细胞外基质的降解、肿瘤血管及淋巴管的生成对肿瘤细胞的侵袭转移起着至关重要的作用。近年来对CDl47与肿瘤的关系研究发现，CDl47广泛表达于人体多种细胞，在膀胱癌、肺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤，结直肠癌，子宫内膜癌等多种肿瘤细胞中表达增加。CDl47可调节血管内皮生长因子而对肿瘤的血管生成有促进作用，也可以刺激成纤维细胞产生金属基质蛋白酶（MMP2、MMP9等），其通过水解Ⅳ型胶原破坏肿瘤细胞周围的基底膜和调节VEGF而影响肿瘤细胞的生长、浸润和转移。Zheng等在对胃癌的研究中发现，CD147表达增强具有促进血管生成及VEGF表达的作用。黎明等在对膀胱移行细胞癌的研究中发现，多数患者都存在CD147和VEGF共同表达，且两者呈正相关（r=0.406，P<0.01）。Tang等在共培养的乳腺癌细胞和成纤维细胞中，CD147过表达时VEGF的表达上调；抑制CD147的表达、中和CD147蛋白的活性或抑制MMP的活性，都会使VEGF的表达受到抑制。Tang等还对VEGF产生过程中可能的信号通路如P13K-Akt、MAPK、JUN、p38激酶进行了研究。发现在MDA-MB-231乳腺癌细胞系中，过表达的CDl47只能刺激Akt和MAPK的磷酸化，而不能刺激JUN和p38激酶的磷酸化。而抑制CDl47的表达会抑制Akt和MAPK的磷酸化。这些结果表明在肿瘤细胞和成纤维细胞中，CDl47是通过P13K-Akt途径调节VEGF的表达。

VEGF-C是VEGF家族成员之一，是特异的促淋巴管内皮生长因子和肿瘤血管生成标志物，在促进肿瘤淋巴管和血管生成以及肿瘤转移起重要作用。其受体有VEGFR-2（FLK-1）和VGEFR-3（fit-4）。VEGF-C对VEGFR-3（fit-4）有更高的亲和力，与之优先结合，VEGF-C与VEGFR-3结合后通过MEK/ERK和P13K-Akt途径引起淋巴管内皮细胞增生，VEGF-C蛋白水解后的成熟形式还可结合并激活VEGFR-2，作用于血管、淋巴管内皮细胞。近年来许多研究表明多种人类肿瘤表达VEGF-C，大部分中VEGF-C表达上调，且与局部淋巴结转移有关。

本研究运用免疫组织化学方法对CDl47在57例肺鳞癌、腺癌中的表达进行了分析。结果显示CDl47和VEGF-C在肺鳞癌和腺癌中高表达，阳性率分别为58.70%（27/46）、81.82%（9/11）和60.87%（28/46）、90.91%（10/11），二者之间无显著统计学差异。CDl47和VEGF-C在有淋巴结转移组的阳性率分别为82.76%（24/29）、82.76%（24/29），显著高于无淋巴结转移组42.86%（12/28）、50.00%（14/28）（P<0.05）；TNM分期Ⅲ+Ⅳ期组的阳性率分别为94.44%（17/18）、94.44%（17/18）显著高于I+Ⅱ期组的48.72%（19/39）、53.85%（21/39）。CDl47和VEGF-C的高表达与有无淋巴结转移及TNM分期密切相关，而与患者年龄、性别、吸烟等临床因素及肿瘤组织类型、细胞分化程度无明显的相关性。本研究结果显示有淋巴结转移的患者和肿瘤后期的患者CDl47和VEGF-C的阳性表达率明显增高，说明CDl47和VEGF-C与肺鳞癌、腺癌的侵袭和转移能力正相关。与王莉等对CDl47的研究及陈苏娟等对VEGF-C的研究结果一致。

目前国内对CDl47和VEGF-C的相互作用尚未见文献报道。黎明等在对膀胱移行细胞癌的研究中发现，多数患者都存在CD147和VEGF共同表达，且两者呈正相关。Tang等试验表明，CDl47通过P13K-AKT途径调节VEGF的表达，从而加速肿瘤血管的生成。VEGF-C是VEGF家族成员之一，可以调节肿瘤血管及淋巴管的生成，其主要作用是促进肿瘤淋巴管的生成。在本研究中，笔者发现在肺鳞癌、腺癌中出现CDl47和VEGF-C联合表达的比例较高，在36例CDl47阳性的病例中有30例VEGF-C表达阳性，二者表现出明显的正相关（P<0.01）。提示CDl47和VEGF-C这两种蛋白在肺鳞癌、腺癌中可能发挥协同作用，CDl47也可能上调VEGF-C的表达，促进肿瘤淋巴管的生长及肿瘤细胞的转移。

综上所述，CD147和VEGF-C在肺鳞癌、腺癌中的表达与肿瘤的临床分期及淋巴结转移关系密切，CD147和VEGF-C即可以作为独立因素也可能相互协同促进肺鳞癌、腺癌的侵袭与转移，二者均可作为判断肺癌预后的参考指标。