菩人丹超微粉对糖尿病大鼠视网膜细胞间黏附分子-1表达的影响

菩人丹超微粉对糖尿病大鼠视网膜细胞间黏附分子-1表达的影响

崔秀成董志军

(承德医学院附属医院眼科，河北承德067000)

摘要〔〕目的探讨探讨菩人丹超微粉(PRD)对糖尿病大鼠视网膜细胞间黏附分子(ICAM-1)表达的影响。方法36只Wistar大鼠随机分为3组，正常对照组、糖尿病模型组和PRD治疗组，每组12只。糖尿病模型组和PRD治疗组大鼠均采用链脲佐菌素连续腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。模型成功建立后，PRD治疗组大鼠给予PRD灌胃，时间为3个月。采用SP免疫组织化学染色法、Western印迹法检测视网膜ICAM-1蛋白的表达；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测视网膜ICAM-1 mRNA的表达。结果糖尿病模型组与正常对照组比较，大鼠视网膜ICAM-1蛋白及mRNA表达均明显升高(P<0.01)，PRD治疗组与糖尿病模型组比较，大鼠视网膜ICAM-1蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.01)。结论PRD可通过下调ICAM-1的表达，抑制糖尿病大鼠视网膜炎症反应，发挥对糖尿病视网膜损伤的保护作用。

关键词〔〕菩人丹超微粉；糖尿病视网膜病变；细胞间黏附分子-1

中图分类号〔〕R774.1〔

基金项目：河北省中医药管理局资助项目(2014066)

通讯作者：董志军(1978-)，男，硕士，副主任医师，主要从事糖尿病视网膜病变的研究。

第一作者：崔秀成(1964-)，男，副主任医师，主要从事糖尿病眼病研究。

糖尿病视网膜病变(DR)是常见的糖尿病微血管并发症，是导致不可逆性盲的重要原因之一〔1，2〕。研究表明〔3〕，细胞间黏附分子(ICAM)-1介导的炎症反应在DR的发生发展中起重要作用，抑制眼内ICAM-1失衡是DR防治的重要靶方向。菩人丹超微粉(PRD)针对糖尿病病机关键“热、虚、瘀”，依据传统方，并结合临床研究及现代药理学研究成果，确立以苦瓜为君药，人参、丹参为臣药，葛根、何首乌、水蛭为佐使药的菩人丹中药组方。诸药协同，益气养阴，调畅气血，化瘀通络。现代药理研究证实PRD具有抑制氧化应激、对抗细胞凋亡和衰老、改善微循环、促进组织修复与再生等作用〔4〕。前期研究证实：PRD能有效修复2型糖尿病大鼠损伤的胰岛β细胞、降低血糖，并具有保护糖尿病并发的大血管、微血管病变等作用〔4，5〕。本文旨在通过观察PRD对糖尿病大鼠视网膜ICAM-1表达的影响，探讨PRD对糖尿病大鼠视网膜炎症病变的保护作用。

1材料与方法

1.1药物与试剂PRD由苦瓜、人参、丹参、制首乌、葛根、水蛭按10∶1∶3∶1∶1∶0.3的比例组方提取而成，每1 g超微粉相当于8～15 g生药，由中央民族大学中国少数民族医学研究院提供；链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司；Trizol，美国Invitrogen公司；ICAM-1兔抗多克隆抗体，武汉博士德生物工程公司；ICAM-1引物，上海生工公司；SP免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物技术公司；蛋白定量试剂盒，北京索莱宝生物科技有限公司；RT-PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。

1.2实验动物清洁级雄性Wistar大鼠〔北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2006～0009〕，体质量200～250 g。动物的饲养和实验过程遵循中国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。

1.3动物模型制备及分组将36只大鼠应用随机数字表法进行完全随机化分组，分为正常对照组、糖尿病模型组和PRD治疗组，每组12只。糖尿病模型组、PRD治疗组大鼠均采用质量分数2% STZ(25 mg·kg-1·d-1)腹腔注射建立糖尿病动物模型，每日注射1次，连续3 d，以血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准〔6〕。模型成功建立后，模型组大鼠不做任何处理；按体表面积折算确定PRD治疗组大鼠给药剂量为每日1.8 g/kg，连续灌胃3个月。

1.4标本制备给药结束后，10%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 g/kg)大鼠，迅速取出双侧眼球。一侧眼球浸于4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，备用于免疫组织化学染色；另一侧眼球迅速在动物手术显微镜下冰面上钝性分E离视网膜，投入液氮中保存，分别备用于Western印迹及RT-PCR检测。

1.5免疫组织化学染色检测ICAM-1蛋白的表达眼球平行视神经连续矢状切片，片厚4 μm，采用SP免疫组织化学染色法检测视网膜ICAM-1蛋白表达。 一抗稀释浓度均为1∶100，DAB显色，苏木素复染细胞核。以0.01 mmol/L PBS代替一抗作为阴性对照，以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性反应。

1.6Western印迹检测视网膜ICAM-1蛋白的表达取液氮中保存的视网膜组织，提取蛋白质，以BCA蛋白试剂盒定量蛋白浓度。蛋白上样量为50 μg，12% SDS-PAGE凝胶电泳，80～120 V、2 h，电泳完毕后转移至硝酸纤维素膜；5% 脱脂奶粉TBST封闭2 h；加入1∶200稀释的ICAM-1抗体，4℃过夜；洗膜后用1∶5 000稀释的二抗辣根过氧化物酶(HRP)交联物室温摇床孵育1 h；Super ECL Plus超敏发光液显影。采用Quantity One-4.6.2软件对显影条带进行分析，以ICAM-1条带与β-actin条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.7RT-PCR法检测视网膜ICAM-1 nRNA表达视网膜组织，在液氮中碾磨成粉末，按Trizol总RNA抽提说明书操作，提取视网膜组织的总RNA。取5 μl RNA，1%琼脂糖凝胶电泳，可见明显的28 s、18 s和5 s三条完整的条带，说明抽提的总RNA比较完整；紫外分光光度计检测OD260/OD280值为1.9～2.1，说明RNA没有被污染。取3 μg总RNA为模板逆转录成cDNA，反应条件为：30℃，10 min；55℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5min。PCR反应条件：94℃，2 min；94℃，30 s；50℃～65℃，30 s；72℃，1 min，第二步起循环。ICAM-1引物序列为：正义链：5’ ACCCACCTCACAGGGTACTTC 3’，反义链：5’ GAGTCTGCTGAGACCCCTCTT 3’，退火温度为60℃，29个循环，产物大小为233 bp；β-actin引物序列为：正义链:：5’CATCCTGCGTCTGGACCT 3’，反义链：5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’，退火温度为58℃，29个循环，产物大小为480 bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄像，并用Quantity One-4.6.2软件进行定量分析，以目的条带的光密度与β-actin条带光密度的比值，作为ICAM-1 mRNA表达的相对水平。

1.8统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2结果

2.1免疫组织化学检测结果ICAM-1免疫阳性产物位于胞质，呈棕黄色颗粒状，免疫阳性细胞主要分布于视网膜神经节细胞层及内核层。糖尿病模型组ICAM-1阳性产物表达明显强于正常组，胞浆呈深棕黄色；PRD治疗后，ICAM-1阳性产物表达较模型组减弱，胞质呈棕黄色。

2.2Western印迹法检测结果在蛋白Marker的97 kD、43 kD水平处，分别可见ICAM-1的蛋白条带及β-actin条带。糖尿病模型组与正常对照组比较，大鼠视网膜ICAM-1蛋白表达明显升高(P<0.01)；PRD治疗组与糖尿病模型组比较，大鼠视网膜ICAM-1蛋白表达明显降低(P<0.01)。见表1。

2.3RT-PCR检测结果在DNA Marker的233 bp、480 bp水平处分别可见清晰的ICAM-1及β-actin mRNA条带。糖尿病模型组与正常对照组比较，大鼠视网膜ICAM-1 mRNA表达明显升高(P<0.01)；PRD治疗组与糖尿病模型组比较，大鼠视网膜ICAM-1 mRNA表达明显降低(P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠视网膜ICAM-1蛋白及

与糖尿病模型组比较：1)P<0.01

3讨论

视网膜微血管系统的损害是DR的重要特征，血-视网膜屏障(BRB)功能障碍和视网膜新生血管形成是DR的主要病理改变，是导致DR患者视力损害的主要血管性因素〔7〕。近年的观点认为DR是一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病，炎症因子过度表达介导的炎症反应在糖尿病视网膜微血管损伤中起到了关键作用，特别是ICAM-1被认为是与DR联系紧密的炎症因子〔8〕。

ICAM-1是一种对免疫反应、炎症反应有重要调节和介导作用的炎症因子〔9〕。正常生理情况下，低浓度的ICAM-1及其配体在维持正常组织结构，参与细胞凋亡、增殖过程中起重要作用。Zhu等〔10〕研究表明，在STZ致糖尿病大鼠模型的视网膜组织中的ICAM-1表达异常升高，应用ICAM-1抑制剂后可以改善高血糖时视网膜炎性病变，提示ICAM-1在DR微血管病变过程中发挥重要作用。

本研究发现，糖尿病模型大鼠视网膜ICAM-1蛋白和mRNA的表达均明显增高。糖尿病时慢性高血糖可引起代谢发生异常，导致视网膜毛细血管结构和功能破坏，引起视网膜血流动力学改变，视网膜处于缺血、缺氧状态，细胞内活性氧产生，导致视网膜氧化应激、局部炎症反应增强，进而诱导强有力的炎症分子ICAM-1表达异常升高，高表达的ICAM-1使白细胞淤滞，白细胞黏附可引起视网膜毛细血管内皮细胞的凋亡，激活血小板，导致血流缓慢和血栓形成、毛细血管无灌注的形成及血视网膜屏障破坏，从而促进DR的发生发展〔8〕。

本研究表明PRD可通过下调视网膜组织ICAM-1的表达，减少视网膜微血管渗漏及病理性新生血管生成，发挥对糖尿病视网膜微血管损伤的保护作用。由于PRD可发挥中药组方多环节、多靶位的治疗优势，且对人体无毒性，避免了化学合成药物带给人体的不良反应，因此可能为DR治疗提供新的方法。

4参考文献

1Zhang W，Liu H，Al-Shabrawey M，etal.Inflammation and diabetic retinal microvascular complications〔J〕.J Cardiovasc Dis Res，2011;2(2):96-103.

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4庞宗然，赵玉堂，李静华，等.菩人丹超微粉对肥胖型2型糖尿病大鼠糖代谢相关指标的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2010；16 (5)：107-10.

5庞宗然，刘祖涵，苏晓惠，等.菩人丹超微粉对肥胖型T2DM大血管损伤大鼠ET-1、NO、FFAs含量的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(10):1779-80.

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7Pelzek C，Lim JI.Diabetic macular edema：review and update〔J〕.Ophthalmol Clin North Am，2002;15(4)：555-63.

8Zhang XL，Wen L，Chen YJ，etal.Vascular endothelial growth factor up-regulates the expression of intracellular adhesion molecule-1 in retinal endothelial cells via reactive oxygen species，but not nitric oxide〔J〕.Chin Med J(Engl)，2009;122(3)：338-43.

9Kim YS，Park GB，Song HK，etal.Cross-linking of cd54 on Burkitt lymphoma cell line Raji and Ramos induces FasL expression by reactive oxygen species and apoptosis of adjacent cells in Fas/FasL interaction〔J〕.Immunotberapy，2007;30(7)：727-39.

10Zhu Y，Zhang XL，Zhu BF，etal.Effect of antioxidant N-acetylcysteine on diabetic retinopathy and expression of VEGF and ICAM-1 from retinal blood vessels of diabetic rats〔J〕.Mol Biol Rep，2011;28(9)：〔Epub ahead of print〕.

〔2013-08-12修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)