维生素C对挤压伤缺血/再灌注引起的心肌功能损伤的影响

2015-12-28邢兆国常军英贾东昭王彦志李琦军

河北医科大学学报 2015年7期

关键词：抗坏血酸

邢兆国，常军英，贾东昭，王彦志，李　炎，李琦军

(河北省石家庄市第三医院创伤一科，河北石家庄 050011)

维生素C对挤压伤缺血/再灌注引起的心肌功能损伤的影响

邢兆国，常军英，贾东昭，王彦志，李炎，李琦军*

(河北省石家庄市第三医院创伤一科，河北石家庄 050011)

[摘要]目的观察维生素C(vitamin C，VitC)对大鼠挤压综合征(crush syndrome,CS)模型缺血/再灌注引起心肌损伤的改善情况，以及对生存率的影响。方法SD大鼠随机分为对照组、CS组、CS+VitC-10组、CS+VitC-20组、CS+VitC-40组，复制CS模型，大鼠双侧后肢挤压6 h，然后再灌注生理盐水以及不同剂量VitC(10、20、40 mg/kg)6 h，收集血液用于生化分析，同时收集组织样品用于RT-PCR与Western Blot分析。结果挤压伤后CS组血钾(K+)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌酸激酶心肌同功酶(creatine kinase MB,CK-MB)、血浆心钠素(atrial natriuretic factor，ANP)较对照组升高，但CS组血钙(Ca2+)、内皮素1(endothelin-1,ET-1)较对照组下降(P<0.05)；与CS组相比，CS+VitC-10、20、40组K+、BUN、Cr、CK的含量显著降低，Ca2+、ET-1含量显著升高(P<0.05)。VitC-20组和VitC-40组的生存率高于CS组(P<0.05)。结论VitC对CS模型缺血/再灌注引起的心肌损伤具有细胞保护作用，并有助于提高大鼠CS模型的生存率。

[关键词]挤压综合征;心肌再灌注损伤;抗坏血酸;大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.012

挤压综合征(crush syndrome,CS)是交通事故、地震、战争和恐怖袭击等灾害中的主要致死原因[1]。当大腿压迫(缺血)1 h以上，然后解除压力(再灌注)后引起肌细胞破裂即横纹肌溶解[2]。外伤性横纹肌溶解患者往往伴随着血容量不足和血管通透性增加，有时会诱发高血压和代谢性酸中毒。肢体挤压伤对机体产生的影响是广泛而复杂的[3]，在肢体缺血/再灌注时，细胞内的钾离子通过破坏的细胞膜大量进入体循环，导致心脏骤停，高血钾对心脏的损害最为严重，可直接导致心电紊乱，是CS常见的死因之一。在大鼠挤压伤的早期，心肌细胞就存在一定程度的损伤[4]，这种损伤可能与血浆儿茶酚胺、血管紧张素(angiotensin，Ang)Ⅱ升高，血浆心钠素(atrial natriuretic factor,ANP)、内皮素(endothelin,ET)-1浓度的改变有密切关系。目前，CS的推荐治疗方案是生理盐水及时补液，加入碳酸氢盐和甘露醇纠正高钾血症。有研究报道，抗氧化剂和自由基清除剂[如维生素C(vitamin C，VitC)]可以治疗和预防缺血/再灌注引起心律失常与全身性炎症反应，但是明确的作用效果与作用机制还不十分清楚。本研究采用大鼠挤压伤致股骨干骨折模型，系统比较挤压伤大鼠与正常大鼠心功能指标的变化，观察生理盐水联合VitC治疗对挤压伤后心脏损伤的改善情况，以便能更好地指导临床。报告如下。

1材料与方法

1.1动物模型的建立与分组雄性SD大鼠140只购于河北省实验动物中心，体质量250～300 g。其中40只随机分为对照组、CS组、CS+VitC-10组、CS+VitC-20组、CS+VitC-40组各8只。对照组不挤压；CS组、CS+VitC-10组、CS+VitC-20组、CS+VitC-40组均采用自制挤压器械，压力为3 kg，连续挤压双下肢6 h造成肢体挤压伤后，再分别灌注生理盐水以及不同剂量VitC(10、20、40 mg/kg)。另100例用于生存率的研究。

1.2血液和组织取样分别从各组股动脉取血2 mL，应用全自动生化检测仪，检测血钾(K+)、血钙(Ca2+)、肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)以及肌酸激酶(creatine kinase,CK)的改变。应用ACS-180型自动化学发光系统，检测肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)及肌酸激酶心肌同功酶(creatine kinase MB,CK-MB)浓度；应用放射免疫法检测血浆内活性物质ANP、ET-1浓度。各组大鼠在取血后处死，打开胸腔，在心脏仍跳动时剪开心脏，取部分心肌应用光学显微镜观察挤压伤后不同时间段心肌组织光学病理变化情况；用RT-PCR和Western Blot技术，观察心功能相关指标(如ANP和ET-1)的变化。

1.3心肌组织形态学观察取部分心肌组织置于冷 PBS 中洗净残留血液，放入 10% 福尔马林中固定至少24 h，乙醇梯度脱水，低温石蜡垂直定向包埋，5 μm厚度连续切片，常规 HE 染色。并于光镜下观察、照相，进行图像学分析。

1.4RT-PCR用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA，以此为模板，以Oligo(dT)16为引物，按照PE公司Taqman反转录试剂盒说明书合成互补脱氧核糖核酸 (complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)。以cDNA为模板，分别加入大鼠ANP、ET-1和c-Fos基因的引物，以GAPDH为内参照，按照PCR Kit说明书进行PCR。所用引物序列如下：ANP上游引物为5′-GGCTCCTTCTCCA-TCACCAA-3′，下游引物为5′-TGTTATCTTCGG-TACCG-3′；ET-1上游引物为5′-AACCATGGA-TTATTTGTCCATG-3′，下游引物为5′-AGTG-TTGACCCAAATGATGTCC-3′；c-Fos上游引物为 5′-CAGCCTTTCCTACTACCAT-3′，下游引物为5′-CCTATTCCTTTCCCTTCG-3′；GAPDH上游引物为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.5Western印迹分析按常规方法收集和裂解细胞,取上清,用改良Lowry法进行蛋白定量。取等量的蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE),半干法将分离胶上的蛋白转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上; 以5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h,加入一抗4 ℃过夜,Tris盐酸缓冲液洗膜后，以辣根过氧化物酶标记的IgG二抗37 ℃封闭2 h,增强化学发光法发光成像。

1.6生存率分析CS组、CS+VitC-10组、CS+VitC-20组、CS+VitC-40组大鼠各25只分别挤压6 h后，观察48 h再灌注的生存率。

2结果

2.1各组主要生化指标的变化挤压伤后血清K+、BUN、Cr、CK较对照组升高(P<0.05)；与CS组相比，CS+VitC-10、-20、-40组血清K+、BUN、Cr、CK的含量显著降低(P<0.05)，并且呈剂量依赖关系。Ca2+则在解压后与对照组比较有所下降，CS+VitC-10、-20、-40组血清 Ca2+的含量显著升高，并且呈剂量依赖关系。见表1。

表1各组大鼠血清K+、Ca2+、BUN、Cr、CK比较

Table 1Serum K+,Ca2+,BUN,Cr and CK in rats of different groups

组别K+(mmol/L)Ca2+(mmol/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)CK(U/L)对照组5.28±0.372.96±0.478.652±1.18 64.96±10.222102.35±621.41 CS组11.27±1.97*1.49±0.59*29.47±6.21*199.98±24.03*15745.52±2643.36*CS+VitC-10组7.98±1.38*#1.89±0.38*#17.39±7.26*#102.72±20.14*#4576.63±1252.94*#CS+VitC-20组6.18±1.49*#△2.37±0.57*#△10.71±6.64#△89.68±18.93*#△2793.48±712.31*#△CS+VitC-40组5.79±1.56#△2.69±0.37*#△☆9.93±5.89#△78.01±15.62*#△☆2418.36±684.85#△ F22.54012.03917.45568.476135.271 P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05与对照组比较#P<0.05与CS组比较△P<0.05与VitC-10组比较☆P<0.05与VitC-20组比较(q检验)

2.2各组血清中cTnI、CK-MB 水平的改变挤压伤后血清cTnI、CK-MB水平明显升高(P<0.05)；与CS组相比，CS+VitC-10、-20、-40组血清cTnI、CK-MB的含量显著降低(P<0.05)。见表2。

表2各组大鼠血清cTnI、CK-MB比较

Table 2Serum cTnI and CK-MB in rats of different groups

组别cTnI(μg/L)CK-MB(U/L)对照组0.45±0.19 2338.30±613.70CS组9.47±4.56*8951.56±1023.24*CS+VitC-10组4.19±1.56*#4021.87±983.79*#CS+VitC-20组1.78±0.34*#△2228.39±820.17#△CS+VitC-40组1.15±0.27*#△☆1952.38±648.43#△ F22.96599.177 P0.0000.000

*P<0.05与对照组比较#P<0.05与CS组比较△P<0.05与VitC-10组比较☆P<0.05与VitC-20组比较(q检验)

2.3各组血浆、心肌组织中ANP、ET-1水平的改变大鼠血浆 ANP 含量在挤压伤后上升，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而与CS组相比，CS+VitC-10、-20、-40组血清 ANP的含量显著下降(P<0.05)。血清 ET-1 水平则在伤后 6 h 有所下降，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与CS组相比，CS+VitC-10、-20、-40组血清ET-1的含量显著升高(P<0.05)。见表3。

RT-PCR和Western印迹分析结果显示，挤压伤后心肌组织ANP mRNA与蛋白质水平较对照组均下降，而CS+VitC-10、-20、-40组心肌组织ANP mRNA与蛋白质水平均显著升高。挤压伤后心肌组织ET-1 mRNA与蛋白质水平较对照组均升高，而CS+VitC-10、-20、-40组心肌组织ET-1 mRNA与蛋白质水平均显著降低(图1)。

表3各组大鼠血清ANP、ET-1比较

Table 3Serum ANP and ET-1 in rats of different groups

组别ANPET-1对照组31.79±21.47 458.38±40.18 CS组78.08±34.32*298.28±64.87*CS+VitC-10组56.04±27.89*349.08±77.14*CS+VitC-20组38.32±22.37#421.98±47.18#△CS+VitC-40组34.50±25.54#437.78±43.16#△☆ F4.22411.361 P0.0070.007

*P<0.05与对照组比较#P<0.05与CS组比较△P<0.05与VitC-10组比较☆P<0.05与VitC-20组比较(q检验)

图1各组大鼠心肌组织中ANP与ET-1表达的变化

A.RT-PCR；B.Western Blot

Figure 1ANP and ET-1 expression in rat myocardium of different groups

2.4各组心肌光镜 HE 染色结果对照组心肌组织正常，微细血管、心肌间质完好，细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，核膜完整；CS组心肌组织水肿改变、肌间水肿加重，炎症细胞有所增多；CS+VitC-10组心肌纤维肿胀程度较轻，少许纤维断裂，心肌结构稍乱，出血，伴炎细胞浸润；CS+VitC-20组，肌间水肿吸收，心肌纤维肿胀程度较轻，少许纤维断裂，心肌结构稍乱(图2)。

图2各组心肌HE染色结果

A.对照组；B.CS组；C.CS+VitC-10组；D.VitC-20组

Figure 2HE staining in myocardium of rats in different groups

2.5各组大鼠生存率比较VitC-20组和VitC-40组的生存率高于CS组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4　各组大鼠生存率比较

*P<0.05与CS组比较#P<0.05与VitC-10组比较(χ2检验)

3讨论

严重肢体挤压伤后发生缺血/再灌注损伤，不仅造成挤压部位的功能损伤，再灌注使挤压部位的代谢毒性物质进入血液循环，影响循环系统血管内皮及心肌组织，相应可引起心脏功能损伤，可能有心力衰竭及其他改变。细胞内容物大量释放入血,产生高钾血症、肾功能障碍，表现为血清BUN、Cr、K+浓度明显升高[5]。本研究结果表明，挤压伤后血清K+、BUN、Cr较对照组升高，说明挤压后的确发生心肌继发性损伤；但CS+VitC-10、-20、-40组血清K+、BUN、Cr、CK的含量显著降低，且呈剂量依赖关系，说明VitC可以改善缺血/再灌注诱导的心肌损伤。另外，损伤引起的胞膜通透性增加，大量Na+内流，通过Na+-Ca2+交换，胞内Ca2+明显上升，使细胞Ca2+超载，加重细胞损伤，而血清Ca2+则明显下降[6]。本研究结果表明，挤压伤后血清Ca2+较对照组显著下降，CS+VitC-10、-20、-40组血清 Ca2+的含量明显升高，说明VitC可以缓解缺血/再灌注损伤引起的心肌损伤。

CK在肌细胞中含量丰富，而CK-MB以心肌细胞含量多[7]，cTnI为心肌肌钙蛋白的组成成分之一，只在心肌中表达，具有高度的组织特异性。研究表明，心肌细胞损伤后，cTnI释放入血，使血清浓度增加，血清cTnI升高的幅度与心肌损伤的程度具有明显的一致性，可作为心肌损伤的特异指标[8]。本研究结果显示，挤压伤后6 h大鼠血清CK-MB与cTnI升高，提示在挤压伤的早期就可能有心肌损伤的存在；而CS+VitC-10、-20、-40组血清 CK-MB与cTnI的含量明显降低，说明VitC可以缓解缺血/再灌注损伤引起的心肌损伤，导致生存率从28%(CS组)提高到64.0%(VitC-20组)和72.0%(VitC-40组)。

为了探讨VitC缓解肢体挤压伤后心肌继发损伤的可能机制，本研究检测了血浆ANP和ET-1浓度的变化。ANP是近年来发现的血管活性物质，由心房肌细胞合成和分泌，具有血管舒张、外周阻力减少、肾排水排钠增多等生理作用[9]。ANP也可存在于血浆和脑脊髓液中，血浆中的ANP来源于心脏心肌分泌[10]。本研究结果显示，挤压伤后血浆与心肌组织中ANF的水平较对照组均降低，而静脉注射VitC后ET-1的水平均显著升高。

ET-1主要由血管内皮细胞合成和分泌，具有强烈的缩血管作用；在生理状态下，ET-1能够维持正常的血管张力和心肌收缩力，对心脏具有正性变力和正性变时效应。ET-1在慢性心力衰竭、高血压、肾脏疾病的发生中具有重要作用[11]。故心肌及血浆内ET-1的水平是心肌损伤的一个重要活性物质，可以作为临床判定心肌损伤损害程度的指标[12]。本研究结果显示，挤压伤后血浆与心肌组织中ET-1的水平较对照组均升高，而静脉注射VitC后ET-1的水平均显著降低，从而降低心肌损伤，并且改进CS大鼠的生存率。

综上所述，在CS大鼠模型中静脉给药VitC可以明显降低缺血/再灌注诱发心肌损伤，并且可以提高生存率。

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