液相色谱-串联质谱法同时测定地榆槐角丸中9种化学成分

靳怡然,田婷婷，贺　璠，马英华，许慧君，杜英峰*

(1.河北医科大学药学院药物分析学教研室，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄 050000)

液相色谱-串联质谱法同时测定地榆槐角丸中9种化学成分

靳怡然1,2,田婷婷1，贺璠1，马英华1，许慧君1，杜英峰1*

(1.河北医科大学药学院药物分析学教研室，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄 050000)

[摘要]目的建立液相色谱-串联质谱法同时测定地榆槐角丸中芦丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黄芩苷、染料木素、芦荟大黄素、大黄酸和大黄素含量的方法。方法采用C18色谱柱，乙腈-0.1%乙酸水为流动相，梯度洗脱。采用电喷雾离子源，监测模式为负离子，定量检测采用多重反应离子模式。结果在15 min内地榆槐角丸中9种有效成分在所测定的浓度范围内线性关系均良好，加样回收率(n=3)分别为96.2%、97.5%、98.3%、99.6%、97.5%、100.1%、94.2%、98.7%和99.7%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)值分别为1.3%、1.2%、1.4%、1.7%、0.5%、0.54%、0.9%、1.0%和0.82%。结论该方法简便、准确、重现性好、专属性高，可用于地榆槐角丸的质量控制。

[关键词]地榆槐角丸；色谱法，液相；串联质谱法；含量测定

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.001

地榆槐角丸是由地榆炭、蜜槐角、炒槐花、大黄、黄芩等12味中药组成的市售中药复方制剂，属国家中药保护品种，收载于2010年版《中国药典》一部，现有大蜜丸和水蜜丸2种剂型。临床上主要用于治疗脏腑实热、大肠火盛所致的肠风便血、痔疮肛瘘、湿热便秘、肛门肿痛等症[1]。中药材的质量受多种因素影响，如药材的基源、产地、采收期等，且中成药是多种药味按不同生产工艺制成的，其质量更具有不稳定性和不均一性，因此仅靠一个或少数几个化学成分作为定量指标来控制中成药的质量是远远不够的。2010年版《中国药典》仅收载以槐角苷为指标成分，文献报道也仅对地榆槐角丸中单一成分或少数几个成分如芍药苷、橙皮苷、黄芩苷等进行含量测定来控制制剂质量[2-3]，但地榆槐角丸成分复杂，任何单一成分均不能全面地反映地榆槐角丸的质量。本研究采用高效液相色谱-质谱联用法同时对地榆槐角丸中芦丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黄芩苷、染料木素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素9种主要成分进行定量分析，旨在为更好地控制地榆槐角丸的质量提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器美国安捷伦-1200 高效液相色谱仪，配有G1322A型在线脱气仪，G1311A型四元梯度洗脱泵，G1329A型自动进样器，美国Applied Biosystems/MDS Sciex公司3200-QTRAPTM质谱仪，质量分析器为三重四极杆线性离子肼串联，TurboV离子源，Analyst 1.5.2分析软件。德国Satrorius公司BP211D型电子分析天平。乙腈(色谱纯)，水为重蒸水。

1.2试药槐角苷、染料木苷、染料木素、芦荟大黄素对照品购于成都曼斯特生物科技有限公司，其纯度大于98%；芦丁、大黄酸、大黄素、黄芩苷和柚皮苷对照品购于中国食品药品检定研究院。地榆槐角丸(大蜜丸：批号 2010626、2010913、2010821)均由北京同仁堂药业有限责任公司提供。

2方法与结果

2.1色谱和质谱条件色谱柱为安捷伦Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-含0.1%乙酸水(B)，梯度洗脱0～5 min，5%A；5～10 min，5%～30%A；10～15 min，30%～80%A；15～20 min，80%～95%A；20～20.1 min，95%～5%A；柱温30 ℃；流速0.7 mL/min。

离子源为电喷雾离子源；负离子模式监测：源喷射电压为-4 500 V；离子源温度为650 ℃。雾化气、加热气和帘气分别为60、65和25 arbitrary units，接口加热，检测过程全程通入氮气。定量方法采用多重反应离子模式。9种被测成分的离子对、出峰时间、解簇电压和碰撞电压见表1。仪器操作软件Analyst 1.5.2，由Applied Biosystems/MDS Sciex提供。

表1　被测化合物质谱数据统计Table 1　HPLC-ESI-MSn Data of the components

2.2溶液配制

2.2.1对照品溶液的制备分别称取芦丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黄芩苷、染料木素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素对照品适量，精密称定，各置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度分别为0.101、0.108、0.091、0.113、0.094、0.124、0.147、0.124和0.096 g/L的对照品贮备液。精密量取上述各贮备液适量，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释并定容，摇匀，即得一定浓度的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取地榆槐角丸大蜜丸，剪碎，混匀，取本品约0.5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，然后精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理(超声仪功率：100 W；频率：25 kHz)30 min，放冷至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液10 μL 进样分析。供试品和对照品溶液的色谱图见图1。

图1地榆槐角丸样品多重反应监测色谱图

A.对照品；B.样品

1.芦丁；2.槐角苷；3.柚皮苷；4.染料木苷；5.黄芩苷；6.染料木素；7.芦荟大黄素；8.大黄酸；9.大黄素对照品

Figure 1Representative extractions chromatograms of nine compounds in Di-Yu-Huai-Jiao pill

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察精密吸取9种待测化合物对照品混合溶液适量，用50%甲醇分别定量稀释成原浓度的1、2、4、8、16和32倍。按已经确定的色谱和质谱条件测定。以质量浓度C为横坐标X(μg/mL)，以待测化合物的峰面积A为纵坐标Y，绘制标准曲线。回归方程、线性范围及相关系数见表2。

表2　被测成分回归方程、相关系数和线性范围Table 2　Regression equations,correlation coefficients and linearity ranges of the nine compounds

2.3.2精密度取同一对照品混合溶液，连续进样5次，记录色谱峰的峰面积，并计算各峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。结果显示芦丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黄芩苷、染料木素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)值分别为1.7%，2.3%，0.7%，1.5%，0.4%，1.7%，2.2%，1.1%和1.2%，均符合精密度实验的要求。说明该方法的精密度良好。

2.3.3重复性取批号为2010626地榆槐角丸5份，每份精密称取约0.5 g，制备供试品溶液，进样测定，计算9种被测成分含量的RSD。结果显示芦丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黄芩苷、染料木素、芦荟大黄素，大黄酸和大黄素的含量RSD值分别为0.81%、0.63%、0.57%、0.71%、0.46%、0.71%和0.89%，均符合规定。表明本方法重复性良好。

2.3.4供试品溶液稳定性取同一份批号为2010626地榆槐角丸供试品溶液，分别于0、6、12、8和24 h进样分析，并记录各待测化合物的峰面积。结果显示9种被测化合物芦丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黄芩苷、染料木素、芦荟大黄素、大黄酸和大黄素的RSD值分别为0.70%、0.81%、0.63%、0.42%、0.91%、0.51%、0.72%、1.21%和0.91%。表明供试品溶液在室温条件下放置24 h，稳定性良好，可以满足样品测定的需要。

2.3.5回收率取批号为2010626，且已知含量的地榆槐角丸，精密称取约0.25 g，共9份，分别精密加入高、中、低3个水平的对照品，每个水平3份，然后按上述方法操作制备供试品溶液并分析、计算。结果显示芦丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黄芩苷、染料木素、芦荟大黄素、大黄酸和大黄素的平均回收率分别为96.2%、97.5%、98.3%、99.6%、97.5%、100.1%、94.2%、98.7%和99.7%，RSD值分别为1.3%、1.2%、1.4%、1.7%，0.5%、0.5%、0.9%、1.0%和0.8%。表明方法加样回收率结果良好，测定方法准确。

2.4样品测定取地榆槐角丸3批(大蜜丸：批号 2010626、2010913、2010821)，按上述方法制备供试品溶液后按前述色谱条件进行试验，分别记录9个待测化合物色谱峰面积，将待测化合物的峰面积代入各自的标准曲线，分别计算芦丁、槐角苷、柚皮苷、染料木苷、黄芩苷、染料木素、芦荟大黄素、大黄酸和大黄素的含量。每批样品测定3份，结果见表3。

表3　地榆槐角丸中9种有效成分含量统计Table 3　Contents of nine compounds inDi-Yu-Huai-Jiao pill　(n=3，mg/丸,RSD)

3讨论

3.1定量指标的选择地榆槐角丸中地榆碳、槐角和槐花三者均有清热凉血，尤善治下部出血的作用，为方中君药，方中黄芩、大黄等具有清热凉血、通便导滞之功效，为臣药，枳壳理气消积，宽畅通便，为使药。因此，本研究选取了槐角和槐花的主要有效成分槐角苷、染料木苷、染料木素[4-5]，黄芩中主要有效成分黄芩苷，大黄中主要有效成分大黄酸、芦荟大黄素和大黄素以及枳壳中的主要有效成分柚皮苷作为定量指标[6-10]。其中化合物芦丁、柚皮苷、染料木苷、染料木素、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素为地榆槐角丸中首次测定报道。

3.2检测方法的选择研究过程中曾尝试采用高效液相色谱-紫外检测测定地榆槐角丸中9种成分的含量，由于9种待测化合物极性差别很大，加之有些成分在制剂中含量较低，高效液相测定要求化合物能达到完全的分离，紫外检测器的灵敏度及选择性往往达不到测定的要求，但液相色谱-质谱具有灵敏度高、干扰少等优点，故本研究选用液相色谱-质谱联用作为待测化合物的检测方法。

3.3流动相的选择为在相对短的时间内实现被测化合物的有效分离，本研究考察了不同的流动相系统，如乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%乙酸水溶液、甲醇-0.1%乙酸酸水溶液梯度洗脱系统，结果发现乙腈-0.1%乙酸水溶液作流动相使9种成分出峰较快，并可显著改善峰型，提高灵敏度，故确定该系统为本研究流动相。

3.4供试品提取方法的选择本研究对比了加热回流提取和超声提取2种提取方法，结果显示上述2种方法对提取效率无差异，故选择相对简便的超声法作为供试品提取方法。随后比较了不同提取溶剂和提取时间对提取率的影响，结果表明采用纯甲醇超声处理40 min时9种待测化合物特征峰的峰面积不再增加，即能达到最大的提取量，因此最后选定样品1.0 g用50 mL 100%甲醇超声处理40 min进行供试品溶液的制备。

3.5溶液制备方法的选择研究过程中发现供试品溶液以100%甲醇溶液进样时由于供试品溶液和流动相洗脱能力的不匹配导致芦丁和柚皮苷均产生了明显的溶剂效应，为了消除溶剂效应对测定的影响，当供试品溶液和对照品溶液制备时均采用50%的甲醇溶液进行稀释，溶剂效应得到明显改善。

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(本文编辑：许卓文)

·病例报告·

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[中图分类号]R972.6

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)07-0745-05

[收稿日期]2014-11-05；[修回日期]2015-02-03

[作者简介]杨昱(1991-)，女，河北石家庄人,河北医科大学第三医院医学硕士研究生，从事糖尿病及其并发症诊治研究。

*通讯作者。E-mail:zhouyaru_hc@163.com

Simultaneous determination of nine constituents in Di-Yu-Huai-Jiao pill by LC-MS/MS

JIN Yi-ran1,2,TIAN Ting-ting1,HE Fan1,MA Ying-hua1,XU Hui-jun1,DU Ying-feng1*

(1.School of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China；2.Department of

Pharmacy,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China)

[Abstract]ObjectiveTo develop a method for the simultaneous determination of rutin,sophoricoside,naringin,genistin,baicalin,genistein,aloe-emodin,rhein and emodin in Di-Yu-Huai-Jiao pill.Methods C18 column was used with the mobile phase of acetonitrile 0.1% aqueous acetic acid water with gradient elution.The identification and quantification of the analytes were achieved on multiple-reaction monitoring scanning(MRM) under negative ion scanning mode with electrospray ionization(ESI).ResultsThere were significant correlation between the ratio of peak area and the concentration of each compound within the test ranges.The average recoveries(n=3) of the nine compounds listed above were 96.2%，97.5%，98.3%，99.6%，97.5%，100.1%，94.2%，98.7% and 99.7%.The RSDs were 1.3%，1.2%，1.4%，1.7%，0.5%，0.54%，0.9%，1.0% and 0.8%,respectively.ConclusionThe method is simple,accurate and highly reproducible,and can be used for the determination of nine compounds in Di-Yu-Huai-Jiao pill.

[Key words]Di-Yu-Huai-Jiao pill;chromatography,liquid;tandem mass spectrometry;determination