DIAPH-3 蛋白在浸润性乳腺癌组织中的表达及预后的研究

田志辉，王　丹，曹彦坤，马　力，朱　龙，刘月平*

(1.河北医科大学第四医院CT室，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学第四医院病理科，河北 石家庄 050011；3.河北医科大学第四医院放疗科，河北 石家庄 050011；4.河北医科大学第四医院乳腺中心，河北省乳腺疾病诊治中心，河北 石家庄 050011；5.河北省安国市医院CT/MRI室，河北 安国 071200)

DIAPH-3 蛋白在浸润性乳腺癌组织中的表达及预后的研究

田志辉1，王丹2，曹彦坤3，马力4，朱龙5，刘月平2*

(1.河北医科大学第四医院CT室，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学第四医院病理科，河北 石家庄 050011；3.河北医科大学第四医院放疗科，河北 石家庄 050011；4.河北医科大学第四医院乳腺中心，河北省乳腺疾病诊治中心，河北 石家庄 050011；5.河北省安国市医院CT/MRI室，河北 安国 071200)

[摘要]目的检测DIAPH-3蛋白在浸润性乳腺癌组织中的表达，并进一步探讨其表达与浸润性乳腺癌临床病理特征及预后的关系。方法采用RT-PCR及Western Blot法检测27例浸润性乳腺癌组织及癌旁组织中的DIAPH-3 mRNA及蛋白表达。免疫组织化学SP法检测100例浸润性乳腺癌患者中DIAPH-3的蛋白表达，分析患者的临床病理资料，电话随访并计算患者的生存时间。分析DIAPH-3蛋白表达与预后的关系。结果在浸润性乳腺癌组织中DIAPH-3蛋白及mRNA的表达量低于乳腺癌旁组织(P<0.01)；淋巴结转移个数多、脉管有瘤栓、神经受侵患者DIAPH-3的表达阳性率低(P<0.01)；Kaplan-Meier生存分析生存分析显示，DIAPH-3低表达的患者5年生存率较低。Cox比例风险模型多因素分析显示，DIAPH-3蛋白表达率低是浸润性乳腺癌患者生存时间的影响因素(P<0.05)。结论DIAPH-3与浸润性乳腺癌的预后有关，可作为评价浸润性乳腺癌预后的生物学指标。

[关键词]乳腺肿瘤；基因；DIAPH-3；预后

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.013

浸润性乳腺癌的发生发展是多方面促成、多阶段的连续过程。研究表明，在肿瘤发展转移过程中，DIAPH-3 蛋白起着极其重要的作用，且与靶向药物抗药性密切相关。本研究检测DIAPH-3在浸润性乳腺癌组织中的表达，探讨其与浸润性乳腺癌临床病理特征及预后的关系。

1资料与方法

1.1标本来源收集2013 年10—12月河北医科大学第四医院手术切除原发性浸润性乳腺癌组织及癌旁组织样本27 例，患者均为女性，年龄28～71 岁，中位年龄55岁。另收集同医院2008年手术切除原发性浸润性乳腺癌标本100例，随访资料完整，患者均为女性，年龄20～88岁，中位年龄51岁。所有患者术前均未接受过放化疗和内分泌治疗，生存时间为34～59个月，中位生存时间54个月，结果均经病理诊断证实。同时收集同期手术切除乳腺纤维腺瘤标本22例作为对照组，患者均为女性，年龄22～78岁，中位年龄48岁。3组年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要试剂兔抗人DIAPH-3多克隆抗体购自Proteintech生物技术有限公司。逆转录试剂盒购自德国Thermo公司。DIAPH-3引物、RNA提取试剂购自上海生工生物科技有限公司。PCR扩增试剂盒购自美国Promega公司。

1.3方法

1.3.1RT-PCR法检测Trizol一步法提取总RNA。1.5%琼脂糖凝胶电泳试验检测总RNA完整性。逆转录为cDNA，进行PCR 扩增。DIAPH-3反应体系：取1 μL cDNA产物按照PCR扩增试剂盒要求扩增。DIAPH-3引物序列，Sense Primer：5′-AGACCTCCACTTCCCAACCT-3′，Anti Sense Primer：5′-CTCACAGGATTGCTGGTCAA-3′，产物长度368 bp。GADPH引物序列，Sense Primer：5′-CTCAGACACCATGGGGAAGCTGA-3′,Anti Sense Primer：5′-ATGAGCTTGAGGCTGTTGT-CATA-3′，产物长度450 bp。反应条件为DIAPH-3：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；52 ℃ 45 s；72 ℃ 50 s，循环35次；72 ℃延伸5 min,4 ℃冷却。PCR 产物行2%琼脂糖凝胶电泳试验。经Alphaease 凝胶成像系统扫描摄像测量灰度值。

1.3.2Western Blot法检测新鲜浸润性乳腺癌组织加入裂解液后冰上研磨，提取组织总蛋白，并应用考马斯亮蓝蛋白定量后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(本实验用12%分离胶)。转膜仪将蛋白转移至聚偏氟乙烯(poly vinglidene fluoride,PVDF)膜上，洗膜后进行二氨基联苯胺(diaminobenzine,DAB)显色。观察并分析显得结果。

1.3.3免疫组织化学法检测免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(streptavidin-perosidase,SP)法。每次免疫组织化学染色均设同步阳性和阴性对照(DIAPH-3阳性对照为宫颈鳞状细胞癌组织，阴性对照均用PBS代替一抗)。

1.4判定标准

1.4.1RT-PCR以人磷酸苷油酸脱氢酶(phosphogly cerate dehydro-genase，GADPH)为内参，测定目的基因灰度值，计算相对表达量。相对表达量=目的基因灰度值/GADPH灰度值。

1.4.2Western Blot以GADPH为内参，测定目的蛋白灰度值，计算相对表达量。相对表达量=目的蛋白灰度值/GADPH灰度值。

1.4.3免疫组织化学SP法于光镜下观察，DIAPH-3 免疫阳性反应产物均沿乳腺导管上皮细胞膜内侧线性分布，呈棕黄色或棕褐色颗粒状，于胞浆内也可见着色。于40倍物镜镜下随机选取至少10个视野范围或每个视野范围至少200个细胞。染色强度标准：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色颗粒为2分，棕褐色颗粒为3分。阳性细胞百分比标准:阴性为0分，阳性细胞<10%为1分，10%～25%为2分，>25%～50%为3分，>50%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积>3分为免疫反应阳性。

2结果

2.1不同临床病理特征 DIAPH-3蛋白的表达免疫组织化学结果显示DIAPH-3蛋白表达率随淋巴结转移个数的增加而减少(P<0.01)；DIAPH-3蛋白在有脉管瘤栓患者的表达低于无脉管瘤栓患者(23.5%vs49.0%)(P<0.01)；DIAPH-3蛋白在有神经受侵患者的表达低于无神经受侵患者(19.4%vs45.3%)(P<0.01)；DIAPH-3 蛋白表达在不同年龄、不同组织学分级、不同肿瘤最大直径、不同临床分期之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　浸润性乳腺癌患者不同病理

*P<0.05与无淋巴结转移比较(χ2检验)

2.227例浸润性乳腺癌组织及癌旁组织中DIAPH-3 mRNA的表达RT-PCR 法和Western Blot 法均显示，乳腺癌组织中的DIAPH-3表达均低于乳腺癌旁组织(P<0.01),见表2、图1～2。

表2RT-PCR 和 Western Blot法检测浸润性乳腺癌组织和

癌旁组织中DIAPH-3的表达

Table 2Expression of DIAPH-3 protein in invasive breast

cancer and cancer adjacent tissues by RT-PCR and

Western Blot

组别RT-PCRWesternBlot乳腺癌组织 0.596±0.0940.233±0.086乳腺癌旁组织1.034±0.0960.941±0.249t 16.93913.965P 0.0000.000

图1浸润性乳腺癌癌及癌旁组织中DIAPH-3的RT-PCR表达

T.癌组织;NT.癌旁组织

Figure 1Expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer and adjacent tissues by RT-PCR

图2浸润性乳腺癌癌及癌旁组织中DIAPH-3的Western Blot表达

T.癌组织;NT.癌旁组织

Figure 2Expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer and adjacent tissues by Western Blot

2.3浸润性乳腺癌组织及乳腺纤维腺瘤中DIAPH-3 蛋白的表达免疫组织化学结果显示DIAPH-3蛋白在浸润性乳腺癌组织中的表达阳性率低于乳腺纤维腺瘤组织中的表达阳性率，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3　免疫组织化学法检测DIAPH-3在浸润性

2.4DIAPH-3与浸润性乳腺癌预后Kaplan-Meier单因素生存分析显示，DIAPH-3 蛋白表达水平降低与患者5年生存率降低有关，36例DIAPH-3表达阳性的患者较64例DIAPH-3表达阴性的患者5年生存率高(P<0.05)，见表4。

2.5Cox多因素生存分析DIAPH-3蛋白表达减少与预后有关(P<0.05)，可以作为判断浸润性乳腺癌患者预后的影响因素，见表5，6。

表4　不同DIAPH-3表达浸润性乳腺癌5年生存率比较

表5　Cox多因素分析的赋值

表6　影响浸润性乳腺癌预后的Cox回归分析

3讨论

DIAPH-3 蛋白属于Formin 蛋白家族，具有促进肌动蛋白的聚集成核、延伸、加帽及微丝的继续伸长等作用，进而调控细胞黏附、运动、细胞形态学分化、细胞内运输、囊泡运输等过程[1-6]。有研究证实，DIAPH-3基因的沉默使不稳定的微管蛋白生成，诱使细胞内吞作用障碍，激活下游Ras/Raf/MEK/ERK 信号传导通路[7]。同时，DIAPH-3可以与Rho激酶结合调节细胞的迁移、黏附、浸润、分化等过程[8]。研究表明，DIAPH-3在细胞侵袭中扮演重要角色。DIAPH-3沉默在前列腺癌或其他类型细胞中导致了由干细胞向变形细胞的转变，同时也引起了癌细胞的转移、侵袭[9]。

DIAPH-3基因的沉默阻止细胞的树突状伪足样运动、侵袭及基底膜的降解，通过改变胶原蛋白Ⅰ的构型，DIAPH-3的沉默行为促进了细胞侵袭。在Hela细胞中观察到DIAPH-3基因的沉默阻碍细胞出胞过程，且有利于细胞的爬行[10]。然而DIAPH-3在浸润性乳腺癌组织中的表达还鲜有研究。

本研究RT-PCR及Western Blot结果显示DIAPH-3在浸润性乳腺癌组织中mRNA及蛋白表达均低于乳腺癌旁组织。100例不同临床病理特征的浸润性乳腺癌组织免疫组织化学结果显示，DIAPH-3表达减弱或缺失与肿瘤的淋巴结转移、脉管瘤栓出现、神经受侵有关，提示DIAPH-3表达减弱或缺失可能诱导浸润性乳腺癌侵袭及转移；而DIAPH-3表达减弱与浸润性乳腺癌临床分期和组织学分级无关。根据此结果推测有2种可能：①经Cox多因素生存分析，DIAPH-3为预后的影响因素，提示DIAPH-3蛋白可能为贯穿浸润性乳腺癌整个发生发展过程的作用因子，其作用并不依赖于其他因素，独立影响肿瘤的侵袭及转移；②在浸润性乳腺癌发生发展过程中存在与DIAPH-3蛋白拮抗的因素。

本研究Kaplan-Meier单因素生存分析结果显示DIAPH-3与浸润性乳腺癌患者的预后有关；Cox多因素生存分析显示DIAPH-3为浸润性乳腺癌预后的影响因素，提示检测患者组织内的DIAPH-3表达，有助于临床对于患者预后的评价和治疗。然而在浸润性乳腺癌发生发展中，DIAPH-3的缺失与肿瘤的淋巴结转移的关系及其机制有待进一步的观察证实。

[参考文献]

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[9]Kim J,Morley S,Le M,et al.Enhanced shedding of extracellular vesicles from amoeboid prostate cancer cells: potential effects on the tumor microenvironment[J].Cancer Biol Ther,2014,15(4):409-418.

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[10]Stastna J,Pan X,Wang H,et al.Differing and isoform-specific roles for the forming DIAPH3 in plasma membrane blebbing and filopodia formation[J].Cell Res 2012,22(4):728-745.

(本文编辑：许卓文)

·论著·

·论著·

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第二医院主治医师，医学硕士，从事小儿肝胆疾病超声诊断研究。

[中图分类号]R737.9

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)07-0792-05

[收稿日期]2014-12-19；[修回日期]2015-03-09 2015-01-19；[修回日期]2015-02-02

[基金项目]河北省医学科学研究重点课题计划(20120016) 河北省医学科学研究重点课题计划(ZL20140026)

[作者简介]李国慧(1976-)，女，河北井陉人，河北省儿童医院主管检验师，医学硕士，从事临床检验学研究。 剧红娟(1982-)，女，河北石家庄人，河北医科大学

*通讯作者。E-mail：zhangtongdiyouxian@163.com

Expression of DIAPH-3 protein and prognosis in invasive breast cancer

TIAN Zhi-hui1,WANG Dan2,CAO Yan-kun3,MA Li4，ZHU Long5,LIU Yue-ping2*

(1.Department of CT,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;

2.Department of Pathology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,

China;3.Department of Radiation Oncology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050011,China;4.Breast Center,the Fourth Hospital of Hebei Medical

University,Hebei Breast Center,Shijiazhuang 050011,China;5.Department of

CT/MRI,the Hospital of Anguo City,Hebei Province,Anguo 071200,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer,then to explore the relationship between protein expression and clinicopathological features of invasive breast cancer as well as prognosis.MethodsmRNA and protein expression of DIAPH-3 in 27 cases of invasive breast cancer and cancer adjacent tissues were examined by RT-PCR and Western Blot.Immunohistochemical SP method was used to examine the expression of DIAPH-3 protein in 100 cases of invasive breast cancer.The clinical data were analyzed and the overall survival of the patients was followed up by telephone.ResultsThe mRNA and protein expression of DIAPH-3 in invasive breast cancer were significantly lower than those of cancer adjacent tissues(P<0.01).The invasive breat cancer tissure showed the features:more number of lymph node metastasis,vascular vessel with tumor bolts,lower DIAPH-3 positive in invasive nerve.The decreased expression of DIAPH-3 associated with lower five-year survival rate of patients.Multivariate analysis showed that the expression of DIAPH-3 significantly related to survival(P<0.05).ConclusionThe expression of DIAPH-3 related to the prognosis of invasive breast cancer,and the item can be a biological indicator to evaluate the prognosis of invasive breast cancer.

[Key words]breast neoplasms;genes;DIAPH-3;prognosis