林蛙卵雌二醇的超临界CO2萃取及酶联免疫分析

邢燕，邱芳萍，纪可，杜琳

（长春工业大学，吉林长春130012）

林蛙卵雌二醇的超临界CO2萃取及酶联免疫分析

邢燕，邱芳萍*，纪可，杜琳

（长春工业大学，吉林长春130012）

以长白山林蛙卵为原料，研究超临界CO2萃取林蛙卵中的雌二醇的工艺条件。探讨萃取压力、萃取温度、CO2流量和萃取时间对雌二醇萃取率的影响，并采用酶联免疫分析法检测林蛙卵雌二醇的含量。结果表明最佳萃取条件为萃取压力30MPa，萃取温度47℃，CO2流量为12 kg/h，萃取时间为90min。酶联免疫分析得到林蛙卵中雌二醇的含量为38.11 ng/L。

超临界CO2萃取；林蛙卵；雌二醇；酶联免疫分析

长白山林蛙（Rana chensinensis Changbaishanensis）属中国林蛙长白山亚种，主要在我国的东北长白山和小兴安岭地区有分布，林蛙卵的药理作用研究在国内未见有太多的报道，因其有显著的抑制血小板聚集、降血脂及降低过氧化脂质含量等相关作用，所以被认为是一种天然的优质的保健食品原料，有相关资料报道，林蛙卵中含有18种氨基酸其中必需氨基酸的总量可达到28.93%、富含雌二醇孕酮等，是中国药典中收录的重要名贵中药之一。雌激素可缓解或消除绝经前后引起的更年期症状，可保护神经元，对改善骨密度，预防骨质疏松具有一定的作用，此外，雌激素还能增加大脑皮质血液的供应，雌二醇是雌激素中的生物活性最强的一种激素，林蛙卵常常被废弃，我们从废弃的原料中提取有很大利用价值的雌二醇鲜见有相关文献报道。

超临界萃取技术因其提取温度低，尤其适宜于提取热敏性有效成分；传质速率快，萃取率高；相对与传统方法工艺流程简单，因此便于过程中的调节；惰性无毒，产品中没有溶剂残留，从萃取到分离可以一步完成，萃取后的CO2不会残留在萃取物上，且比较容易从产物中进行分离出来，基于以上的特点，超临界萃取的应用范围越来越广泛。酶联免疫测定法具有快速、灵敏、特异、简便等优点，同时还具有检测成本低，便于大批量样品检测等特点，因此具有广泛的实际应用价值。本文中采用超临界CO2流体萃取林蛙卵雌二醇，研究萃取压力、温度、CO2流量和萃取时间对萃取得率的影响，并用酶联免疫分析进行检测，为林蛙卵雌二醇的实际应用提供理论指导和实验依据。

1 材料与方法

1.1 原料及预处理

试验原料为长白山新鲜林蛙卵，经处理后备用。

1.2 设备

HA221-40-11超临界萃取装置：江苏华安科研仪器有限公司；林蛙雌二醇ELISA试剂盒：上海士锋生物科技有限公司；酶标仪：北京普朗9602A酶标仪。

1.3 试验内容

选用超临界CO2萃取方法进行林蛙卵雌二醇的萃取。

准确称取4 550 g干燥粉碎后的林蛙卵粉装入料筒，将料筒装入萃取缸，装上料筒O型圈再放入通气环，盖好压环及上堵头，进行萃取试验。在林蛙卵雌二醇萃取过程中选取萃取压力15、20、25、30、35MPa，萃取温度37、42、47、52、57℃，CO2流量8、10、12、14、16 kg/h和萃取时间30、60、90、120、150min，以林蛙卵雌二醇的萃取得率为考察指标，进行单因素试验。雌二醇萃取得率按下列公式计算：

得率=（提取物质量/林蛙卵粉质量）×100%

2 结果与分析

2.1 压力对雌二醇提取物得率的影响

调节萃取温度为47℃，CO2流量为12 kg/h，萃取时间90min，萃取得率随温度的变化如图1所示。

图1 萃取压力对萃取得率的影响Fig.1 Effects of extraction pressure on yield of estradiol

由图1可知，随着压力的增加，萃取得率也相应有大幅度的提高，当萃取压力达到30MPa时，继续增加压力，得率增加的趋势较为平缓接近于平稳，且在30MPa时对雌二醇提取物已达到较好的提取效果，故选择30MPa为最佳萃取压力。

2.2 萃取温度对雌二醇提取物得率的影响

调节萃取条件维持压力30 MPa，CO2流量为12 kg/h下萃取90min，温度对萃取得率的影响如图2所示。

图2 萃取温度对萃取得率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction yield of estradiol

由图2可知，雌二醇提取物得率在37℃～47℃范围内随温度的增加而增加，47℃可达到最大值，47℃后再升高温度，萃取得率反而呈下降的趋势。这是因为当温度升高时，分子运动加快，分子间相互碰撞的机会相对增加，挥发性和扩散系数会提高，溶解能力会增大，但温度升高的同时，CO2分子间距增大，作用力减小，密度减小，又会导致溶解能力下降，综合考虑上述因素选择47℃为最佳萃取温度。

2.3 CO2流量对雌二醇提取物得率的影响

调节萃取条件在萃取温度47℃，压力30MPa下萃取90min，可得CO2流量与得率的关系如图3所示。

图3 CO2流量对萃取得率的影响Fig.3 Effects of CO2flow rate on yield of estradiol

由图3可知，随着CO2流量的增加萃取得率增加，达到12 kg/h时再增加CO2流量萃取得率开始下降，这是因为CO2流量对萃取得率有着复杂的影响，当增加CO2流量时，CO2流体通过萃取釜的速度增大，在萃取釜中停留的时间短与原料接触的时间少，对萃取能力的提高不利；与此同时，CO2流量的增加导致CO2流体通过林蛙卵粉层的速度加快，传质推动力会相应增加，传质系数增加对萃取能力的提高是有利的。通过实验得出在萃取雌二醇时CO2流量为12 kg/h时，得率较高。因此，选择最佳CO2流量为12 kg/h。

2.4 萃取时间对雌二醇提取物得率的影响

选择在萃取压力30MPa，温度47℃，CO2流量为12 kg/h条件下，萃取不同的时间，得率见图4。

由图4可知，随着萃取时间的增加，萃取物得率增加，但当萃取时间达到90min以后，随着时间的延长得率增加很缓慢，考虑到现实中的经济因素，再继续延长萃取时间是不合理的，所以选择最佳萃取时间为90min。

图4 萃取时间对萃取得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on yield of estradiol

2.5 林蛙卵雌二醇的酶联免疫分析结果

采用林蛙雌二醇（E2）酶联免疫分析（ELISA）检测超临界CO2萃取林蛙卵中雌二醇的含量。ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中林蛙雌二醇（E2）水平。用纯化的林蛙雌二醇（E2）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入雌二醇（E2），再与HRP标记的雌二醇（E2）抗体结合，形成抗体—抗原—酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的雌二醇（E2）呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中林蛙卵雌二醇（E2）含量。

在酶标包被板上设标准孔10孔，依次稀释后各孔加样量都为50μL，浓度分别为48、32、16、8、4 ng/L。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，得到标准曲线为：y=（-1.819 8）+25.484 01x，R2=0.999 1。

将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数得到超临界萃取林蛙卵中雌二醇的含量为38.11 ng/L。

3 结论

通过单因素试验确定了超临界萃取林蛙卵雌二醇的最佳工艺条件为萃取压力30MPa，萃取温度47℃，CO2流量为12 kg/h，萃取时间为90min，并通过酶联免疫分析法测得其雌二醇含量为38.11 ng/L。超临界流体由于其独特的优点，使其与常用的其他有机溶剂相比，是一种环境友好型溶剂。使用超临界CO2作为有机溶剂的替代品，应用在生物、医药、食品包装和环保等领域是现在及未来的一个发展趋势。酶联免疫分析降低了分析成本，加快了分析速度，灵敏度高，特异性强，在检测方面受到越来越多科研工作者的青睐。

[1]王文珺,赵继勋,李季.己烯雌酚及其免疫检测技术概述[J].中国畜牧杂志,2005,41(4):64-7

[2]李青,张东霞,方赤光,等．畜禽肉及动物内脏中雌二醇残留量的测定[J]．中国公共卫生,2004,20(12):1510

[3] 林素珠,天然雌激素研究展望[J].海峡药学,2004,16(3):11-15

[4]宋玉卿,于殿宇,张晓红,等.大豆胚芽油的超临界超临界CO2萃取研究[J].食品科学,2007(10):293-296

[5] Wang W J,Li J,Zhao JX,et al.Development of monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay to the estrogen diethylstilbestrol[J].Chinese Journal of Chemistry,2006,24:1758-1765

[6] Cliquet P,Goddeeris BM,Okerman L,et al.Production of penicillinspecific polyclonal antibodies for a group-spe-cific screening ELISA[J].Food and Agricultural Immunology,2007,18(3):237-252

[7]易军鹏,朱文学,马海乐,等．牡丹籽油超临界二氧化碳萃取工艺[J]．农业机械学报,2009,40(12):144-150

[8] 陈永红.食品和生物材料中微量甾体激素提取方法的进展[J].中国公共卫生,1997,13(2):119-121

[9]张镜澄.超临界流体萃取[J].北京:化学工业出版社,2000:7-26

[10]唐韶坤.超临界二氧化碳萃取葡萄籽中食用及药用成分的工艺和模型研究[D].天津:天津大学,2003

[11]汉丽梅,汉丽萍,杨桂琴.中国林蛙繁殖期雌蛙卵巢组织学变化和血清雌二醇水平的检测[J].中国兽医科技,2002,32(3):29-30

[12]何方洋,万宇平,李静,等.雌二醇残留ELISA检测试剂盒的研制[J].畜牧与兽医,2011,43(8):60-62

[13]邓安平,Franek Milan.酶联免疫吸附分析法测定水样中的阿特拉津[J].分析化学,1998(1):29-33

[14]卢立明,宋少江,武勇,等.哈士蟆卵油化学成分研究(Ⅱ)[J].沈阳药科大学学报,2002,19(1):25-26

[15]程建,申文忠,刘以红.天然产物超临界CO2萃取[M].北京:中国石化出版社,2009:33-36

[16]程玉华.林蛙卵及其应用[P].中国:99119379.2,2001-12

Supercritical Fluid Extraction of Estradiol from Rana Chensinensis Egg and Analysis by ELISA

XING Yan，QIU Fang-ping*，JI Ke，DU Lin
（ChangChun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

The text used Rana chensinensis egg as material，effects of extraction pressure，temperature，flowrate and time on yield of estradiol extracted by supercritical carbon dioxide were studied，and the content of estradiol was detected by ELISA.The results showed that the optimal extraction conditions were follow：extraction pressure 30 MPa，temperature 47℃，carbon dioxide flowrate 12 kg/h and extraction time 90min.The content of estradiol detected by ELISA was38.11 ng/L.

supercritical CO2extraction；Rana chensinensis egg；estradiol；ELISA

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.003

2013-12-13

吉林省科技发展计划项目（20110252）

邢燕（1988—），女（汉），硕士研究生，研究方向：生物技术应用。

*通信作者