窖藏马铃薯干腐病病原菌的分离及绿色防治技术研究

刁小琴，关海宁，魏雅冬，马雪，李杨，郭丽，马松艳

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

窖藏马铃薯干腐病病原菌的分离及绿色防治技术研究

刁小琴，关海宁，魏雅冬，马雪，李杨，郭丽，马松艳

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

窖藏“黄麻子”马铃薯干腐病的病原菌主要为燕麦镰刀菌。4℃的低温可以抑制镰刀菌的生长。该菌在pH 3～11范围内均能生长，低于5和高于9时生长较缓慢。壳聚糖和VC均能抑制该病原菌的生长，0.5%的壳聚糖抑菌效果显著，VC含量越高，抑菌效果越明显。臭氧对该病原菌有一定的抑制作用，每隔一天用输出量400mg/mL的臭氧发生器处理8min，可有效抑制该病原菌。

马铃薯；干腐病；分离；绿色防治

马铃薯是世界上仅次于水稻、小麦、玉米的第四大作物，营养十分丰富[1]，在黑龙江省种植广泛，是重要的经济作物。马铃薯除鲜销外，其余均用于贮藏便于反季销售。然而在窖藏过程中，块茎常发生腐烂，不但影响商品品质，而且缩短了贮藏期，造成了较大的经济损失。据调查，由镰刀菌引起的干腐病是马铃薯的主要采后病害，贮藏期间发病率可高达30%[2-3]，该病害严重阻碍了马铃薯产业的进一步发展。目前，有研究对不同地区马铃薯干腐病镰刀菌进行了分离鉴定[4-5]，而对于黑龙江省引起“黄麻子”马铃薯干腐病病原菌的分离鉴定及抑制研究很少有报道。同时对于病害的抑制方面，多采用喷洒化学杀菌剂，该法虽然可以进行有效控制，但由于存在药物残留、环境污染等问题而逐渐被限制。因此，本研究在对病原菌鉴定的基础上采用消费者可以接受的绿色防治技术抑制菌体的生长，以期为防治窖藏马铃薯干腐病提供理论基础，同时对黑龙江省农业结构调整、新农村建设及促进农民增收具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离、纯化和鉴定

供试马铃薯块茎预冷后贮藏于窖中，选择表皮局部颜色发暗、褐色，发病部略微凹陷的薯块用蒸馏水洗净，用解剖刀切取约5mm的病健交界处的薯块，于75%的乙醇中浸泡30 s，用无菌生理盐水冲洗3遍，将其置于PDA培养基中分离和纯化。将纯化后的菌种移至PDA平板28℃条件培养，依据真菌手册鉴定。

1.2 病原菌致病性鉴定

根据柯赫氏法则进行致病性测定。将分离纯化后的分离物配成106个孢子/mL的菌悬液用于接种。将马铃薯块茎清洗后用无菌水冲洗，70%酒精表面消毒，用灭菌刀切开一切口，用灭菌棉花蘸菌悬液涂切口，常温贮藏，10 d后观察发病症状和病症形态，分离培养进一步确认鉴定致病菌。

1.3 抑制病原菌生长试验

供试菌种经5 d平板培养，用直径6mm的打孔器打取菌落边缘的菌块，移入新的PDA平板内，根据不同要求进行处理，每个处理均设3个重复。每隔1天使用十字交叉法测量不同处理下的菌落直径，统计各处理间的差异显著性。

1.3.1 温度试验

将移植有菌块的PDA平板置于0、4、15、28、35℃环境下培养。

1.3.2 pH试验

用1mol/LHCl和1mol/LNaOH将PDA培养基调配成3、5、7、9、11等5种不同的pH，移入菌块在28℃下培养。

1.3.3 添加壳聚糖试验

用1.0%（体积分数）的醋酸溶解壳聚糖，配成浓度为5.0mg/mL，经高压灭菌后，加入无菌融化的PDA中，分别获得壳聚糖浓度为0.25%、0.5%、0.75%、1%的培养基，移入菌块在28℃下培养。

1.3.4 添加抗坏血酸试验

将抗坏血酸用无菌水配成浓度为4.0mg/mL的溶液，加入无菌融化的50℃的PDA中，分别获得抗坏血酸浓度为0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL、的培养基，移入菌块在28℃下培养。

1.3.5 臭氧试验

将移植有菌块的PDA平板置于PE塑料袋中，用臭氧输出量400mg/h的臭氧发生器分别处理2、4、6、8、10min后，扎紧袋口30min，打开袋子在室温下培养。每隔1天用臭氧处理1次。

1.4 数据分析

试验数据采用statistix 8.0（Analystical Software Inc.，USA）的Linear Models程序进行，用Tukey HSD程序对差异显著性（P＜0.05）或差异极显著性（P＜0.01）进行分析，采用Sigmaplot10.0软件作图。每个实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

病原菌菌落在PDA培养基上培养8d后，大部分培养基上产生大量絮状白色菌丝，表面呈玫瑰紫色。大型分生孢子两端渐尖，通常为5隔，小型孢子为1隔～2隔，厚垣孢子链生或簇生。菌落形态及孢子形态见图1。

图1 菌落形态及孢子形态Fig.1 Morphology of colony and spore

根据病原菌形态特征，同时参考《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》，初步认定为该病原菌为燕麦镰刀菌（F.avenaceum）。

2.2 病原菌致病性鉴定

马铃薯有伤接种10 d后，薯块表面出现黑褐色凹陷斑块，切开后组织呈黑色至黑褐色，薯块内有空洞，且空洞内有白色菌丝。与自然发病干腐病症状相同，从回接发病的马铃薯块茎中可分离得到原接种病菌。上述结果证明燕麦镰刀菌是引起黄麻子马铃薯干腐病的主要病原菌。

2.3 病原菌生长的抑制试验

2.3.1 温度对病原菌菌落直径的影响

温度是影响马铃薯发病的重要因素之一，适宜的温度有利于病原菌的繁殖、传播[6]，不同温度对病原菌菌落直径的影响见图2。

图2 不同温度对病原菌菌落直径的影响Fig.2 The influence of different temperature on pathogenic bacteria colony diameter

图2可以看出，病原菌在0℃以上均可以生长，随着温度的升高繁殖速度加快，当温度超过28℃，菌落生长速度又呈下降趋势。低温不能完全抑制菌落的生长，但培养10 d后，4℃的处理和0℃的处理差异不显著（P＜0.5），而和其它处理差异显著（P＞0.5）。因此，马铃薯贮藏在4℃的环境中，可以较其它温度更好的抑制病原菌的生长。而贮藏温度为0℃，虽然也能较好的抑制病原菌的生长，但0℃的环境利于水解酶活性的增高，淀粉水解，单糖积累，食用时变甜[7]。因此综合考虑选择4℃贮藏较适宜。

2.3.2 pH对病原菌菌落直径的影响

pH对病原菌菌落直径的影响见图3。

图3 不同pH对病原菌菌落直径的影响Fig.3 The influence of different pH on the pathogenic bacteria colony diameter

图3可以看出，马铃薯病原菌能适应较宽的pH范围，pH在3～11范围内均有不同程度的生长，但生长的最适pH5～9，虽然pH过高、过低都对菌丝生长有一定影响，但不能完全抑制，这说明该菌对pH的适应性较强，给该病害的控制带来一定的困难。

2.3.3 壳聚糖对病原菌菌落直径的影响

壳聚糖在微生物细胞外形成物理屏障，阻碍细胞内外的物质代谢且破坏细胞壁和细胞膜，导致胞内物质外渗，同时会诱导细胞内发生一系列的生化反应[8]。不同壳聚糖浓度对病原菌菌落直径的影响见图4。

图4 不同壳聚糖浓度对病原菌菌落直径的影响Fig.4 The influence of different chitosan concentration on the pathogenic bacteria colony diameter

图4可以看出，壳聚糖处理能够抑制病原菌的生长，且随着浓度的增大，抑菌效果逐渐增强，当浓度超过0.5%后，各处理差异不显著（P＜0.5）。因此考虑到利用壳聚糖涂膜时，如果浓度过高，可能会造成马铃薯的无氧呼吸，因此壳聚糖选择0.5%作为抑菌浓度较合适。

2.3.4 抗坏血酸（VC）对病原菌菌落直径的影响

抗坏血酸由于本身具有酸性或产生的特殊抗坏血酸的氧化物使其具有杀菌作用。不同浓度的抗坏血酸对病原菌的抑制见图5。

图5 不同抗坏血酸浓度对病原菌菌落直径的影响Fig.5 The influence of different VCconcentration on the pathogenic bacteria colony diameter

由图5可以看出，随着抗坏血酸浓度的增大，抑菌效果逐渐增强。当培养10 d后，VC含量为0.4mg/mL的抑菌率超过60%。因此通过用抗坏血酸处理马铃薯不仅可以增加马铃薯的维生素含量，还可以防止其腐烂变质[9]。

2.3.5 臭氧杀菌时间对病原菌菌落直径的影响

臭氧是一种强氧化剂，安全、无毒无污染，生产成本低，具有广谱杀灭微生物的作用[10]，不同臭氧杀菌时间对病原菌生长的影响见图6。

图6 不同臭氧处理时间对病原菌菌落直径的影响Fig.6 The influence of different ozone processing time on the pathogenic bacteria colony diameter

图6可以看出，随着臭氧杀菌时间的延长，病原菌被杀灭的程度逐渐增大，培养10 d后，每天处理8min的菌落直径与每天处理10min的菌落直径差异不显著（（P＜0.5），因此选用每天8min的杀菌强度即可抑制马铃薯干腐病的病原菌。

3 结论与讨论

从感病马铃薯上分离的病原菌，经病害外部症状观察及菌落、孢子形态特征鉴定及致病性检测，确定马铃薯干腐病的主要病原菌为镰刀菌。该病原菌在4℃的环境下被抑制。该菌对pH的适应性较强，这给该病害的控制带来一定的困难。0.5%的壳聚糖能够很好的抑制该病原菌，虽然壳聚糖浓度越高，抑菌效果越好，但考虑到如用高浓度的壳聚糖涂膜，可能会导致马铃薯无氧呼吸而加快腐烂，因此并不是壳聚糖浓度越高越好。而抗坏血酸的添加量应该越高越好，这不仅可以抑制病原菌从而减少腐烂变质，还可以提高马铃薯的VC含量。每天用臭氧处理8min就可以很好的抑制该病原菌，且安全、无污染，如采用更长的时间，抑菌率会有一定程度的提高，但大大造成了资源的浪费。

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Study on Isolation and Green Control Technique of Pathogens Causing Potato Dry Rot Disease during Storage

DIAO Xiao-qin，GUAN Hai-ning，WEI Ya-dong，MA Xue，LI Yang，GUO Li，MA Song-yan
（College of Food and Pharmaceutical Engineering，Suihua University，Suihua 152061，Heilongjiang，China）

The growth of Fusarium could be inhibited at4℃.The bacteria can grow within pH range of 3～11 and grow more slowly below 5 and above 9.Chitosan and VCcan inhibit the growth of the pathogen and antibacterial effect is remarkable by 0.5% chitosan.VCcontent is higher，the antibacterial effect is more obvious.Ozone has certain inhibitory effect and 8min ozone treatment can effectively inhibit the pathogen.

potato；dry rot disease；isolation；green control technique

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.032

2013-08-05

黑龙江省教育厅科学技术研究项目（面上）[12531836]

刁小琴（1979—），女（汉），讲师，研究生，主要从事农产品加工与贮藏的研究教学工作。