胡萝卜多糖降低血糖的功能研究

阚国仕，杨艳侠，陈红漫，任大明，卢铎，赵迪

（沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866）

胡萝卜多糖降低血糖的功能研究

阚国仕，杨艳侠，陈红漫，任大明，卢铎，赵迪

（沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866）

探索胡萝卜多糖对糖尿病小鼠血糖水平的影响以及作用机理。对正常小鼠尾静脉注射四嘧啶建立糖尿病小鼠模型，采用格列本脲和不同剂量的胡萝卜多糖溶液对小鼠进行腹腔注射。小鼠体内药理学研究显示胡萝卜多糖能显著降低糖尿病小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白含量，增加小鼠肝糖原含量。胡萝卜多糖能降低糖尿病小鼠血糖水平，同时增加糖尿病小鼠肝糖原含量，由此推断其降糖机制可能与体内的糖异生作用有关。

胡萝卜多糖；降血糖；糖化血红蛋白；肝糖原

胡萝卜（carrot）又称甘荀，属伞形科二年生草本植物，以肉质根作蔬菜食用，常见的根呈圆柱状和圆锥状，颜色多为橘黄色、白色、黄色和紫色。胡萝卜具有益肝明目、利膈宽肠、健脾除疳等功效。最新研究发现胡萝卜中含有的多糖类化合物具有多种生物活性，比如抗氧化[1]、抗肿瘤、抗病毒、改善机体免疫等，已成为当今新药研究的方向之一，但有关胡萝卜多糖降低血糖水平的相关研究却鲜有报道。胡萝卜多糖是胡萝卜中一类水溶性多糖，是胡萝卜重要的生理活性成分之一，是由许多单糖分子缩合而成的长链结构，经降解转变成可溶性的单糖和寡糖等，本文对胡萝卜多糖进行了提取、分离、纯化，探究胡萝卜多糖的降血糖功效并推测其可能的降糖机理。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜胡萝卜：购于沈阳农业大学院内蔬菜市场；昆明种系小白鼠（雌雄兼用，体重30 g左右）：购于北京实验室动物中心。

四氧嘧啶：美国Sigma公司；格列本脲：北京太洋药业有限公司；木瓜蛋白酶：北京鼎国昌盛生物技术公司；95%乙醇、氯仿、正丁醇均为国产分析纯。

HH-8型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；RE-85Z旋转蒸发器、DHL-A电脑恒流泵、DBS-100电脑全自动部分收集器：上海青浦沪西仪器厂；LGJ-10型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂；Sorvall高速冷冻离心机：凯特试验仪器公司；三诺安稳血糖仪：三诺公司；UNIC7200型可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 热水浸提法提取[2]胡萝卜多糖

将购买的新鲜胡萝卜清洗干净，切成细丝，50℃烘干，碾磨粉碎，40目过筛；称取适量胡萝卜干加5倍体积乙醇，50℃水浴除色素2 h，纱布过滤，弃上清液；滤渣按料液比1∶30加入蒸馏水，60℃水浴浸提8 h，重复浸提3次；合并3次所得滤液，进行抽滤；旋转蒸发仪将滤液浓缩至原来体积的20%；4 500 r/min离心15min；上清液加5倍体积乙醇沉淀24 h；3 500 r/min离心30min，收集沉淀，冷冻干燥，得胡萝卜粗多糖。

1.2.2 木瓜蛋白酶+Sevage法去除杂蛋白[3-4]

配制1%的粗多糖溶液，加入5%木瓜蛋白酶，温度60℃及pH5.0条件下酶解2 h。按照V（多糖溶液）∶V（氯仿）∶V（正丁醇）=25∶5∶1加入3种组分，剧烈搅拌20min，4 500 r/min离心15min。弃去中间白色沉淀和下层油状液体，收集上清液，重复操作3次。所得上清液透析96h，醇沉，离心，冷冻干燥，得胡萝卜精多糖。1.2.3 胡萝卜多糖的纯度鉴定与含量测定

分离纯化后的多糖进行紫外扫描，在260、280 nm处均无吸收峰，说明多糖中无蛋白质、多肽及核酸等物质。以葡萄糖为标准品，苯酚-硫酸法测定吸光度，得出回归线方程y=0.005 9x+0.000 1（图1），计算出胡萝卜多糖的提取率为30%，见图1。

图1 苯酚-硫酸法测定葡萄糖的标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose by phenol-sulfuric acid method

1.2.4 胡萝卜多糖对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖抑制作用的研究

1.2.4.1 糖尿病小鼠模型的构建与给药途径[5]

取体重30 g左右（30±1.0）的昆明种小鼠60只，雌雄同用，每天自由饮食饮水，常规喂养3 d，未发现有异常情况出现。尾静脉采血测定空腹血糖（采血前禁食12 h），确定所有小鼠均属于正常值范围，随机取10只作为正常对照组，剩下的小鼠均用来造模。各小鼠按照50mg/kg尾静脉注射四氧嘧啶溶液（生理盐水配成2.5%四氧嘧啶溶液），正常对照组小鼠注射等体积生理盐水，同样方法连续注射7 d，同时喂饲高脂高热量饲料。血糖仪测定空腹血糖（GLU）≥7.0mmol/L，视为高血糖，同样方法连续测定5 d，空腹血糖（GLU）≥7.0 mmol/L，视为糖尿病造模成功。造模成功的小鼠随机分成5组，分别为胡萝卜多糖高、中、低组，格列本脲组，四氧嘧啶致糖尿病模型组，以后所有小鼠均给予常规饲料，自由摄食饮水。

胡萝卜多糖高、中、低剂量组每天分别按400、200、100mg/kg腹腔注射多糖溶液，阳性对照格列本脲组按200mg/kg腹腔注射，四氧嘧啶模型组和正常对照组分别腹腔注射等体积生理盐水，连续注射8周。每周测量记录各组小鼠的空腹血糖含量和体重。

1.2.4.2 标本采集[6]

最后一次给药后禁食12 h，血糖仪测定各组小鼠GLU后，引颈法处死小鼠，颈动脉插管放血，分离血清，测定HbA1c的含量。取其肝脏，生理盐水清洗至苍白色，用滤纸吸干，称取0.5 g，放入加有30%KOH溶液的试管中编号，沸水浴中煮20min使肝组织全部溶解，取出冷却后，按1∶2（体积比）加入95%酒精。沸水浴中至沸腾，3 000 r/min离心10min。将各管内溶解物分别定量转入25mL容量瓶中，仔细混匀，按照苯酚-硫酸法测定肝糖原含量。

1.2.4.3 指标的检测方法

1）空腹血糖（GLU）测定：取尾静脉血1滴，用三诺血糖仪测定。2）糖化血红蛋白（HbA1c）测定：用离子交换高效液相色谱法。3）肝糖原含量（mg葡聚/g肝组织）计算：葡聚糖含量×25/0.5。

1.3 统计处理

2 结果与分析

2.1 小鼠体型变化

模型构建组小鼠连续注射四氧嘧啶后，呈现与对照组明显不同的外在特征：食量增多，饮水增多，排尿次数增多，尿量增加，体型消瘦，体重下降，呈现糖尿病的明显症状，表明糖尿病模型构建成功，而正常对照组小鼠体重增加，动作敏捷。

胡萝卜多糖高、中、低剂量组每天分别按400、200、100mg/kg腹腔注射多糖溶液，阳性对照格列本脲组按200mg/kg腹腔注射，四氧嘧啶模型组和正常对照组分别腹腔注射等体积生理盐水，连续注射8周。每周测量记录各组小鼠的空腹血糖含量和体重。分别见表1表2。

小鼠体重的变化（表1）表明，建模成功的各组小鼠与正常对照组相比，体重显著性下降（P＜0.05）。给药4周后，与正常对照组相比，模型组体重显著性降低（P＜0.05）；与模型组相比，格列本脲组，多糖高、中、低剂量组体重显著性增加（P＜0.05）。给药8周后，与正常对照组相比，模型组体重显著性降低（P＜0.05）；与模型组相比，格列苯脲组，多糖高、中、低剂量组体重极显著性增加（P＜0.01）；与正常对照组相比，格列苯脲组，多糖高、中剂量组体重无显著差异。表明格列苯脲组，胡萝卜多糖高、中剂量组溶液对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠体重减轻有恢复作用。

表1 胡萝卜多糖对糖尿病小鼠体重的影响Table1 Infection on the weight of diabetic mice

表2 胡萝卜多糖对糖尿病小鼠GLU的影响Table 2 Infection on the GLU of diabetic mice

2.2 小鼠血糖的测定

小鼠血糖的测定结果（表2）表明，建模成功后的各组小鼠与正常对照组相比，血糖存在极显著性差异（P＜0.01），血糖值明显升高。给药2周后，与正常对照组相比，模型组血糖升高，差异极显著（P＜0.01）；格列苯脲组，多糖高、中、低剂量组小鼠血糖显著性降低（P＜0.05）。给药4周后，与对照组相比，模型组血糖升高，差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，格列苯脲组，多糖高、中、低剂量组血糖降低，差异极显著（P＜0.01）。给药8周后，与对照组相比，模型组血糖升高，差异极显著；与模型组相比，格列本脲组，多糖高、中、低剂量组血糖明显下降，差异极显著（P＜0.01）；与格列本脲组相比，高剂量组血糖无显著差异。其中高剂量组小鼠血糖水平下降最明显，与对照组相比，无显著差异，基本达到了正常水平。

2.3 小鼠糖化血红蛋白以及肝糖原测定

1）糖化血红蛋白（HbA1C）测定：用离子交换高效液相色谱法。2）肝糖原含量（mg葡聚/g肝组织）计算：葡聚糖含量×20/0.5。见表3。

给予糖尿病小鼠胡萝卜多糖8周后（表3），与对照组相比，模型组小鼠糖化血红蛋白含量明显升高，差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，格列苯脲组，多糖高、中剂量组糖化血红蛋白极显著降低（P＜0.01），低剂量组无显著性差异；与多糖低剂量组相比，多糖高、中剂量组差异显著（P＜0.05）。

与对照组相比，模型组小鼠肝糖原含量明显降低，差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，格列苯脲组，多糖高、中剂量组小鼠肝糖原显著性升高（P＜0.01），低剂量组肝糖原含量无显著性差异；多糖高、中剂量组与低剂量组相比肝糖原有显著差异（P＜0.05），表明胡萝卜多糖能增强肝脏对葡萄糖的处理，而且与多糖溶液的浓度有关。

表3 胡萝卜多糖对糖尿病小鼠糖化血红蛋白以及肝糖原的影响Table3 Infection on the HbAlc and liver glycogen of diabetic mice

3 结论

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病，可分为Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病，虽然均以血糖升高为特征，但是它们的发病机理却不同。Ⅱ型糖尿病是胰岛B细胞被破坏，导致胰岛素分泌绝对不足[8]，其发病机制与免疫系统的异常有关而一直备受关注。目前的降糖药物在治疗糖尿病方面虽然有一定的疗效，但是存在一定的局限性和不良反应[9]，因此探索新的降糖药物势在必行。一般情况下，血液中多余的葡萄糖转变成糖原贮存在肝脏和肌肉组织中，当血糖下降时，糖原再生成葡萄糖，以维持血糖浓度的相对稳定。据国内外报道促进糖异生作用降糖药是当今一个新的研究思路[10]。糖原的代谢在维持血糖的稳定中起着重要的作用，一些多糖类化合物有促进糖异生的功效[11]，有望降低空腹血糖水平。

本研究通过对昆明种系雄性小鼠腹腔注射四氧嘧啶，破坏胰岛B细胞，导致胰岛素分泌绝对缺乏或胰岛素抵抗，从而成功诱导出糖尿病模型小鼠。对患病小鼠的体内药理学研究显示，胡萝卜多糖可以显著降低四氧嘧啶致糖尿病小鼠的空腹血糖水平和糖化血红蛋白，其降低空腹血糖和糖化血红蛋白水平与格列苯脲相当，同时胡萝卜多糖高，中剂量组小鼠肝糖原含量有显著增加，表明胡萝卜多糖可以促进体内肝糖原的合成。胡萝卜多糖降低糖尿病小鼠空腹血糖水平，增加肝糖原的含量，由此可见，胡萝卜多糖具有降血糖功效。

胡萝卜多糖对糖尿病小鼠的影响是多方面的，但不管是降低血糖、糖化血红蛋白，还是增加肝糖原等相关指标最终均达到减轻病情，阻止或延缓相关并发症出现的目的。我们推测其多种治疗作用可能是通过抑制胰岛B细胞凋亡或改善胰岛B细胞功能，促进糖异生作用而取得的。因此今后亦应加强胡萝卜多糖改善胰岛素分泌缺陷和促进糖异生方面的研究。

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Research on Hypoglycemic Effects of Carrot Polysaccharide

KAN Guo-shi，YANG Yan-xia，CHEN Hong-man，REN Da-ming，LU Duo，ZHAO Di
（College of Biological Science and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，Liaoning，China）

To study the impact as well as the mechanism of the carrot polysaccharides on blood glucose levels in type I diabetic mice．type I diabetes mouse model was established by injection of alloxan for normal mouse tail vein，the glibenclamide and different doses of carrots polysaccharide solution were injected by mice intraperitoneal．vivo pharmacology studies have shown that carrots polysaccharide can significantly reduce fasting glucose levels of diabetic mice，significantly increase the glycogen content of diabetic mice.carrots polysaccharide can reduce fasting glucose of alloxan-induced diabetic mice，its hypoglycemic mechanism may be relevant to the gluconeogenesis of body.

carrot polysaccharide；hypoglycemic；HbA1c；liver glycogen

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.031

2013-08-14

辽宁省教育厅基金资助（No.L2012238）

阚国仕（1971—），男（汉），副教授，硕士，主要从事酶制剂以及多糖生化方面的研究工作。