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β-七叶皂甙钠对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用

2015-12-19杨志勇万海涛程贤亮

中国实用神经疾病杂志 2015年7期
关键词:皂甙脑缺血海马

杨志勇 万海涛 程贤亮

1)上海市同济大学医学院 上海 200333 2)上海市普陀区利群医院神经外科 上海 200333

七叶皂甙钠(商品名:麦通纳)是从七叶树科植物天师栗干燥成熟果实挲罗子,采用先进工艺提取的一种含多酯键三萜皂,有α和β2种异构体。2种异构体理化性质有较大差别,其中β-七叶皂甙钠是主要的活性异构体[1]。七叶皂甙钠具有类皮质激素样抗炎、抗渗出、抗肿胀,增强血管张力、改善微循环及抗氧化、清除自由基等作用。目前,β-七叶皂甙钠已经用于临床多种疾病的治疗,而且取得一定疗效[2]。本实验在大鼠脑缺血-再灌注模型中研究β-七叶皂甙钠的神经保护作用及其潜在机制,以便为临床β-七叶皂甙钠治疗神经系统疾病提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体质量(300±20)g,由第二军医大学实验物中心提供。

1.1.2 主要试剂:多聚赖氨酸(北京中山:生物技术有限公司),0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0),4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH 7.40),0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.40),10%水合氯醛、乙醚。β-七叶皂甙钠针剂(5mg/安瓶)由山东绿叶制药有限公司生产,用0.9%氯化钠溶液稀释成50mg/30mL,以备用。氯化2,3,5-三苯四氮唑(TTC)购于上海生化试剂公司,用0.1mol/L PBS配制成2%TTC磷酸缓冲液,避光备用。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组:所有大鼠予以标准饲料喂养74只大鼠随机分为假手术组(n=18)、缺血-再灌注(IR)组(n=28)和β-七叶皂甙钠组(七叶皂甙,n=28)。再灌注48h时处死检测脑梗死体积、脑水肿、神经功能评分、NISSL染色、TUNEL染色和caspase-3活性。

1.2.2 大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型的制作:①大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型参照Zador等[3]描述的方法,以动物清醒后左前肢不能完全伸展、爬行时向左侧转圈为模型成功标准。假手术组除尼龙线插入深度<15mm外,其余过程同IR组。正常对照组不作任何处理。术后2h,治疗组予以腹腔注射β-七叶皂甙钠(5.0mg/kg),另2组给予腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液,连续用药(1次/d)[4]。

1.2.3 脑梗死体积检测:分别于再灌注后48h,动物采用10%水合氯醛深麻醉,快速开胸暴露心脏,经升主动脉快速灌注37℃肝素化生理盐水250mL以去除血液,断头取脑,将脑放入-20℃冰箱冷冻3min,从前向后连续冠状切片,片厚2mm。将脑片小心放入2%TTC磷酸缓冲液中,37℃孵箱内避光孵育20min,数码相机拍照。经TTC染色后,正常脑组织被染成粉红色,梗死区呈苍白色,界线分明。利用图像分析软件Scion Image检测梗死面积。

1.2.4 脑组织取材和组织切片制备:于再灌注后48h将大鼠腹腔麻醉后经心脏进行灌注固定(各时间点n=5),并断头取脑。从视交叉吻合端至尾端冠状连续切片,片厚3mm。切片常规梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋后,进行切片,片厚5μm,分别进行NISSL染色和细胞凋亡染色。

1.2.5 脑含水量测定:再灌注后48h处死大鼠,取出大脑半球,沿脑桥上界水平切断,然后沿中线切开,分离两侧大脑半球,用滤纸将脑组织表面的液体吸干后,立即在电子分析天平上称取湿质量,然后放入80℃烤箱中烘烤3d,直至质量不再变化,称取干质量。按以下公式计算大脑半球含水量,脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.2.6 凋亡酶检测:按照厂家说明书要求检测caspase-3活性。

1.2.7 神经行为学检测:模型制作后72h,按Longa法5分制标准评分:0分:无神经功能缺损症状;1分:对侧前肢屈曲;2分:向对侧旋转;3分:向对侧倾倒;4分:不能行走或昏迷[5]。

1.3 统计学处理 运用SPSS 18.0统计软件进行方差分析,各组数据以(±s)表示,组间比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-七叶皂甙钠对脑梗死体积的影响 假手术组未观察到明显梗死(n=3)。缺血-再灌注后(n=7),脑梗死体积为(35±6)%。而给予β-七叶皂甙钠治疗后(n=7),大鼠脑梗死体积显著下降(17±8)%(vs I/R组,P<0.05)。见图1。

图1 TTC染色

2.2 β-七叶皂甙钠对脑水肿的影响 结果显示,假手术组(n=5)、I/R组(n=5)和七叶皂甙钠组(n=5)的脑含水量分别为(76.14±0.31)%、(82.45±0.54)%和(79.28±0.37)%。I/R组的脑含水量较正常对照和假手术组显著增加,而七叶皂甙钠治疗后的脑含水量显著下降(vs I/R组,P<0.05)。见图2。

图2 脑含水量检测

2.3 β-七叶皂甙钠对神经功能的影响 结果显示,假手术组(n=5)、I/R组(n=8)和七叶皂甙钠组(n=8)的神经功能评分分别为0、2.6±0.45和1.3±0.36。I/R组大鼠神经功能明显受损,而七叶皂甙钠治疗后能显著改善再灌注后的神经功能(见图3)。

图3 神经功能评分

2.4 β-七叶皂甙钠对脑神经细胞的影响 NISSL染色显示,I/R组出现诸多神经元丢失和死亡细胞。在假手术组和治疗组,海马CA1区的细胞轮廓比较明显,细胞结构紧凑,细胞较大,富含胞浆和NISSL小体。I/R组细胞分布分散,细胞轮廓不清晰。图4显示对NISSL染色进行细胞计数(皮层和海马),结果显示,I/R组的存活细胞数显著低于其他2组。

图4 NISSL染色及神经元计数

2.5 β-七叶皂甙钠对神经细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示,TUNEL阳性颗粒主要位于神经元细胞核内。I/R组损伤细胞主要表现为圆形、皱缩,突出消失或减少,细胞体变圆,细胞核TUNEL染色阳性。但假手术组和治疗组很少见TUNEL阳性细胞。图5为TUNEL阳性细胞计数(皮层和海马),与假手术组相比,I/R组皮层和海马的TUNEL阳性细胞显著增加,而β-七叶皂甙钠治疗能显著降低TUNEL阳性细胞数。

图5 TUNEL染色及凋亡神经元计数

2.6 β-七叶皂甙钠对caspase-3活性的影响 图6为缺血-再灌注损伤后48h检测皮层和海马的caspase-3活性。结果显示,I/R组海马和皮层的caspase-3活性分别为1.27±0.23和1.54±0.25,显著高于对照组。治疗组海马和皮层caspase-3活性(分别为0.34±0.14、0.44±0.13)显著低于I/R组。

图6 皮层和海马caspase-3活性

3 讨论

随着生活水平的提高,脑卒中发病率也呈上升趋势。目前,对于脑卒中的发病机制进行深入研究,但尚未找到特别有效的脑卒中风治疗药物或手段。七叶皂甙钠是由中药娑罗子干燥果实中提取的三萜皂甙钠盐,含多酯键三萜皂甙,有抗渗出、消肿胀、扩张动脉,增加静脉张力,改善微循环和稳定血管内皮细胞及消除自由基的作用[6]。目前,七叶皂甙钠已经用于临床多种疾病的治疗。本实验对七叶皂甙钠治疗脑缺血-再灌注损伤的疗效及其机制进行研究。结果显示,缺血前及再灌注后采用七叶皂甙钠治疗能有效降低脑梗死体积。此外,治疗后的大鼠表现为脑水肿减轻、神经功能改善,可能与治疗能增加存活神经元数和抑制神经元凋亡(凋亡酶活性)有关。

七叶皂甙钠的神经保护作用,可能与下列机制有关:(1)抗炎作用:七叶皂甙钠具有抗蛋白肿胀作用,可使血浆中促肾上腺皮质激素和可的松水平明显升高;(2)抗渗出作用:七叶皂甙钠对致炎物质引起的血管通透性增加有抑制作用,可能与机体静脉组织中前列腺素2α的分泌增加有关;(3)利尿作用:七叶皂甙钠的利尿作用主要是一种类皮质激素样的抗渗出、消肿胀作用,只有在大剂量时才出现;(4)抗氧化、清除自由基:七叶皂甙钠可以有效清除血液中的自由基,特别是对毒性很强的羟自由基有明显清除作用,抑制酶性非酯性引发的脂质过氧化,减轻氧自由基对组织的毒害作用[7];(5)抗凋亡作用:七叶皂甙钠可以抑制凋亡酶的活化,减少凋亡细胞[8]。

本研究从抗凋亡的角度对七叶皂甙钠的神经保护作用进行检测。基于七叶皂甙钠的多效性,其机制应不仅限于对凋亡的影响,其他机制也可能同时参与其神经保护作用。有待更多的研究证实。

[1]周玉宝,庞飞,解放军.β-七叶皂甙钠在神经疾病中的应用[J].中国实用神经疾病杂志,2012,15(16):80-81.

[2]李芸.β-七叶皂甙钠对大鼠脑缺血再灌注损伤后血脑屏障功能和胶质原纤维酸性蛋白表达的影响[J].四川医学,2010,31(10):1 429-1 432.

[3]Zador Z,Stiver S,Wang V,et al.Role of aquaporin-4in cerebral edema and stroke[J].Handb Exp Pharmacol,2009,190(2):159-170.

[4]李启明,沙杜鹃,李瑾,等.腹腔注射β-七叶皂甙钠对缺血-再灌注小鼠脑IL-1/3.AQP4表达的影响[J].江苏医药,2011,37(4):384-387.

[5]鹿寒冰,李晓宾,董瑞国,等.β-七叶皂甙钠对大鼠缺血性脑水肿及水通道蛋白4表达的影响[J].中国脑血管病杂志,2009,6(6):298-303.

[6]朱文侠,王航辉,韩振奎.β-七叶皂甙钠对肠缺血再灌注损伤后肠粘膜屏障功能、形态学变化的影响[J].陕西医学杂志,2012,41(12):1 579-1 581;1 593.

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[8]刘梅,李小刚,谭华.β-七叶皂甙钠对脑缺血-再灌注损伤大鼠自由基的影响[J].中国实用神经疾病杂志,2011,14(17):4-8.

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