大鼠脑室出血后脑干蓝斑内去甲肾上腺素能神经元表达变化的研究

吴 勇 谭 华 李小刚（通讯作者）

泸州医学院附属医院神经内科 泸州 646000

脑室出血分为原发性和继发性两大类，以后者常见。既往研究发现，脑出血后脑组织中NE含量增高，因此，推测脑室出血中NE含量也可能会增高，并加剧了对脑组织及其他器官的损害，加重病情。本实验通过制作大鼠PIVH模型观察脑干组织蓝斑内去甲肾上腺素能神经元的表达变化及对脑水肿、神经行为学评分的影响，进一步探讨NE在IVH损伤中的作用，为临床诊断治疗、预测病情提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂 健康雄性SD大鼠60只，体质量（300±20）g（由重庆医科大学动物科提供），免疫组化观察蓝斑去甲肾上腺素能神经元。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及动物模型建立：实验动物随机分为正常组、假手术组、脑室出血组。参照彭建伟等［1］方法制备PIVH模型。按照Paxinos和Watson［2］《大鼠脑立体定位图谱》确定右侧侧脑室位于Bregma点后0.8mm，旁开1.5 mm，立体定向仪定位后用骨钻钻一直径约1mm小孔，深达硬脑膜表面即可。用微量进样器从左侧股动脉抽取40μL动脉血，25℃恒温水浴箱1～3min使血液稍黏稠，然后固定进样器在立体定位仪上，沿钻孔缓慢进针4.5mm（此处为侧脑室位置）以10μL／min速度将血注入脑室内，留针10min，然后缓慢退针（30s），缝合头皮。假手术组大鼠只切开头皮和颅骨钻孔。手术过程严格无菌操作。整个实验过程保持室温26℃。术后不同时间点6h、1d、3d、5d、7d大鼠断头处死。

1.2.2 观察指标：Hua等［3］的触须诱发前肢放置试验法观察IVH后大鼠的神经行为变化，具体如下：检查者手持大鼠背部皮肤使其四肢悬空，将胡须刷触桌面角边缘，测试同侧前肢的活动情况，未受损者可将前肢迅速放到桌面，脑损伤时此动作有不同程度的损害，大鼠每侧受测10次，前肢触及桌面角边缘次数的百分率即为该得分。该方法能够较敏感反映中枢神经系统损伤的感觉与运动功能障碍。（1）脑组织含水量测定：于实验各相应时间点终止观察，2%戊巴比妥钠深度麻醉动物，迅速断头，开颅取出脑组织，去除脑膜、低位脑干和小脑，先用电子天平称湿质量，后置于电热恒温烤箱，恒温100℃烘烤24h再称量获得干质量，按Elliott公式计算脑组织含水量：含水量＝（湿质量-干质量）／湿质量×100%。（2）脑干蓝斑内DBH神经元DBH阳性细胞计数：采用多巴胺-β-羟化酶（DBH）免疫组化染色。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计分析软件进行数据分析，计量资料用±s表示，各组比较均采用单因素方差分析（one-way ANOVA）的多个样本均数的两两比较法（LSD法），变量之间采用相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

见表1～3。分别为各组大鼠不同实时间点篮板内去甲肾上腺素能神经元细胞熟练、神经行为学评分和脑组织含水量的比较结果。可见IVH组蓝斑内出现大量深染的DBH阳性神经元，形态与正常组、假手术组相似，染色加深，阳性细胞数较正常组、假手术组显著增加（P＜0.05）（表1）。神经行为学评分6h和1d的评分结果明显低于对照组，而注血后3d、5d、7d与2组神经行为学评分结果比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。脑组织含水量IVH组显著高于正常组、假手术组（P＜0.05），术后6h开始升高，1d达高峰，在血肿吸收期（出血后3d）脑组织含水量呈逐渐下降（表3）。

表1 各组大鼠不同时间点LC内DBH阳性神经元数量比较 （±s）

表1 各组大鼠不同时间点LC内DBH阳性神经元数量比较 （±s）

注：与正常组、假手术组比较，＊P＜0.05

组别 术后各时间点6h 1d 3d 5d 7d正常组96±15 97±11 97±7 100±5 95±7假手术组 99±12 100±12 98±16 97±15 94±6 IVH组 208±9＊247±10 ＊218±22 ＊147±6 ＊121±8 ＊

表2 各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较 （%，±s）

表2 各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较 （%，±s）

注：与正常组、假手术组比较，＊P＜0.05

组别 术后各时间点6h 1d 3d 5d 7d正常组 87.00±2.5 88.25±2.76 86.25±1.7 88.25±4.4 87.5±4.0假手术组 86.5±4.6 87.75±3.6 87.00±2.2 88.25±4.3 87.5±4.2 IVH组 76.00±4.5＊66.00 ±2.5 ＊83.5 ±2.6 84.5±4.5 84.7±4.1

表3 各组大鼠不同时间点脑组织含水量比较 （%，±s）

表3 各组大鼠不同时间点脑组织含水量比较 （%，±s）

注：与正常组、假手术组比较，＊P＜0.05

组别 术后各时间点6h 1d 3d 5d 7d正常组 74.75±0.18 74.75±0.09 73±3.1 73.75±1.7 74.2 5±1.7假手术组75.25±0.95 74.25±0.96 73.75±2.61 74.5±0.13 74.25±1.8 IVH组 78.75±0.95＊ 83±0.85＊ 81.5±0.910＊ 77.5±1.3＊ 76.75±0.9＊

3 讨论

蓝斑（LC）位于三叉神经中脑核内侧、第四脑室底与侧壁交界处室底灰质的腹外侧区，整个核团从面神经核平面一直延伸至中脑下丘平面尾侧［4］。文献［5］报道，由于LC独特的色素沉着，很早就被人们在脑干内发现，但对其功能一直缺乏了解，直到用甲醛诱发荧光法发现LC含有儿茶酚胺（几乎全部是NE），人们才认识到LC在机体的重要作用，是神经系统NE的最重要来源，同时50%的去甲肾上腺素能神经元分布在蓝斑。NE以血液中酪氨酸为原料，在胞浆内首先羟化成多巴，再脱羧生成多巴胺（DA），然后DA进入囊泡，在囊泡内经多巴胺-β-羟化酶（DBH）催化生成NE。DBH是合成NE的关键酶，DBH免疫反应阳性不仅可以确定NE能神经元的性质、分布，而且一定程度上可根据免疫阳性产物量的多少及染色深浅确定去甲肾上腺素能神经元内DBH水平、NE含量及变化。因此，DBH是识别去甲肾上腺素能神经元的标志酶。

多种病理情况下，均会引起体内NE含量的改变，参与疾病的病理生理过程。IVH时，极易阻塞脑室系统引发颅内压增高，尤其第三、四脑室积血铸形和脑室扩大使得脑干重要结构受压和破坏，而血肿本身及其分解产物也对脑干、下丘脑有直接损害作用，蓝斑在上述情况下易受到损伤和刺激，去甲肾上腺素能神经元可被激活。激活的去甲肾上腺素能神经元广泛的纤维上传至杏仁体、边缘皮质、新皮质致NE释放，引起相应的反应；下传到脊髓侧角，调节交感神经及肾上腺髓质兴奋，进而引起血浆中去甲肾上腺素浓度迅速上升，参与调控机体对应激的急性反应。本实验中脑室出血后，脑干组织内NE含量急剧升高，加之脑室出血后蓝斑-交感-肾上腺髓质系统兴奋，合成和释放大量NE，由于脑脊液循环受阻，脑脊液屏障（BBB）开放，血中NE可直接进入脑内，导致脑组织NE含量增加。

大量NE聚集在脑组织周围，造成脑组织损伤的原因可能有：（1）激动α1受体-磷脂酶C系统或激动α2受体-腺苷酸环化酶抑制系统升高胞浆Ca2＋浓度，促进神经细胞内Ca2＋库释放增多，磷脂酶A2活化，花生四烯酸代谢后的物质可导致血管收缩，血小板凝集和血管通透性增加，进一步加重脑水肿［6］；（2）促进兴奋性氨基酸（EAA）的释放，增加N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA）受体的敏感性，其结局是引起细胞外Ca2＋大量内流，细胞内Ca2＋超载，过度激活酯酶、激酶和内切酶，进而破坏细胞膜，神经纤维，造成神经细胞结构破坏；（3）通过激活神经元膜上的α1、β肾上腺素受体增加糖利用，提高组织代谢，使脑组织血流和代谢需求不相适应，加重组织乳酸酸中毒［7］；（4）NE可导致神经细胞过度兴奋，加速能量消耗，使维持脑代谢活动的多种酶如Na＋-K＋-ATP酶活性降低，促使神经细胞内外离子分布异常，细胞内外渗透压发生改变，激活位于胞膜上的水通道蛋白（AQP），进而促进水和电解质通过AQP4进入胞内导致细胞水肿［6］，从而引起和加剧脑细胞继发性损害；（5）NE作用于脑内血管壁上α、β受体，使脑血管痉挛，加重脑缺血和水肿坏死；（6）大量NE使脑血管内皮细胞受到损伤，BBB开放，加剧脑水肿［8］；（7）血浆NE升高可直接作用于心血管系统，导致心脏泵血功能下降和外周血管收缩，从而导致脑灌注流量下降［8］，进一步加剧脑组织缺血缺氧；（8）NE有刺激脑细胞分泌脑钠（BNP）的作用，导致低钠血症［9］，这可能与脑组织含水量显著增加有关。因此，脑室出血后，更易损伤和刺激下丘脑、脑干组织，引起神经内分泌网络功能紊乱，打破体内内环境平衡，导致一系列激素、神经递质的含量发生病理性改变，对脑组织本身产生损害，同时也影响全身多器官的功能，诱发和加重多器官功能障碍综合征（MODS），加重病情。

［1］彭建伟，许予明，刘强等.大鼠脑室系统出血模型的建立［J］.中华神经医学杂志，2009，8（6）：563-566.

［2］Paxions G，Watson C.The rar brain in stereotaxic coordinates［M］.San Diego：Academic Press，1997：20-36.

［3］Hua Y，Schallert T，Keep RF，et al.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Stroke，2002，33（10）：2 478-2 484.

［4］贺桂琼，孙善全，余会平，等.吗啡依赖和戒断大鼠脊髓内NA能神经元变化的研究［J］.第三军医大学学报，2005，27（24）：2 414-2 417.

［5］Parent A.Brain and cerebellum［M］／／Carpenter S.human neuroanatomy.9th ed.Philadelphia：Williams and Wilkins，1996：469-519.

［6］丰浩荣.脑出血后脑水肿形成机制研究进展［J］.脑与神经病学杂志，2008，16（2）：156-159.

［7］Hoffman WE，Shu CC.The interaction of glucose and sympathetic activity in stroke［J］.Stroke，1993，24（1）：165.

［8］许志强，蒋晓江，陈曼娥，等.单胺类递质在大鼠脑出血心脏损伤中的作用［J］.脑与神经疾病杂志，2003，11（2）：81-82.

［9］Tomida M，Muraki M，Uemara K，et al.plasma concentration of brain natriuretic peptide in patients with subarachniod hemorrhage［J］.Stroke，1998，29（8）：1 584-1 587.