胃-胰蛋白酶联合酶解阿魏菇蛋白制备抗氧化多肽

王雪铭，许程剑，牛博楠，卢士玲

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

胃-胰蛋白酶联合酶解阿魏菇蛋白制备抗氧化多肽

王雪铭，许程剑*，牛博楠，卢士玲

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

为了建立酶解阿魏菇蛋白制备抗氧化多肽的最佳优化条件，采用胃蛋白酶和胰蛋白酶分步水解的方法。运用四因素三水平的正交试验确定胃蛋白酶的酶解优化组合，以水解度和DPPH自由基清除能力为响应值，最终确定酶解的最优组合为：酶解时间1 h，酶添加量8 000U/g，底物浓度1%，pH2。在此基础上，采用响应面分析法研究胰蛋白酶酶解时间、酶添加量、pH、底物浓度对工艺的影响，以羟自由基（·OH）为响应值，确定的酶解最优条件为：酶解时间1.42 h，酶添加量7 744.93U/g，pH7.96，底物浓度1.35%，此条件下的·OH清除率为74.7%，与理论值75.59%相对误差在1%以内，说明所建立的模型具有较好的拟合性。

阿魏菇蛋白；抗氧化多肽；响应面分析法；最优条件

阿魏菇（Pleurotus ferulae）是新疆特有的菌类，其因寄生或腐生在中药阿魏肥大的根茎部而得名。在我国阿魏菇仅分布于新疆荒漠地区的木垒、托里、阿勒泰、伊梨、塔城等地，与其寄主阿魏的分布是一致的[1]。阿魏菇集食用、药用、美容于一身，营养丰富全面并且各类营养物质含量都很高[2-3]，被誉为当今食用菌“皇后”。阿魏菇菇体洁白高大，肉质细腻鲜嫩，味美可口，营养丰富，其蛋白质含量占干菇的20%，含有18种氨基酸，人体8种必需氨基酸全部具备。阿魏菇还在抗肿瘤，抗疲劳，抗诱变，免疫调节[3-5]等各方面都有良好的开发利用前景。

在新疆阿魏菇资源一直没有得到充分的应用和重视，其一是阿魏菇的价值没有受到重视；其二应该对阿魏菇中的活性成分从分离纯化、理化性质和生物学活性等方面没有进行系统深入的研究。从现有的文献报道了解到，各国学者选用的菌类、产地不一致，因此所分离鉴定的活性物质也不同。近年来，对于阿魏菇的研究主要集中在多糖方面，目前没有研究阿魏菇多肽的相关报道，因此提取阿魏菇中的蛋白质并对其进行酶解制备具有抗氧化活性的多肽，为阿魏菇的深加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿魏菇：新疆清河产；胃蛋白酶：Biotopped；胰蛋白酶：Sigma；甲醛为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-200VDE双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UV759紫外可见分光光度器：上海精科；BS2000电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；LG100B鼓风干燥箱：上海实验仪器厂；Neofuge15R台式高速冷冻离心机：香港力康；真空冷冻干燥：上海爱朗仪器有限公司；酸度计：德国赛多利斯股份公司。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化肽制备流程

阿魏菇蛋白→胃蛋白酶酶解→冷冻干燥→蛋白酶酶解→冷冻干燥

1.3.2 胃蛋白酶酶解条件的确定

胃蛋白酶水解后，以水解度和DPPH自由基清除能力为评价指标，分别研究了酶解时间（1、2、3、4 h），酶添加量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g），底物浓度（1%、2%、3%、4%、5%），pH（1、1.5、2、2.5、3）4个因素，并在此基础上进行了正交试验，正交试验设计表如表1所示。最终确定胃蛋白酶酶解的最优组合。每个实验均重复3次，取平均值。

表1 正交试验因素表Tab le1 Design of factors and levels of orthogonal experiment

1.3.3 胰蛋白酶酶解条件的确定

阿魏菇蛋白经胃蛋白酶酶解后，用胰蛋白酶继续酶解，酶解后以水解度和·OH清除能力为评价指标，考察酶解时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h），酶添加量（4 000、6 000、80 00、10 000、12 000、14 000 U/g），pH（7.5、7.8、8.0、8.2、8.5），底物浓度（0.5%、1%、2%、3%、4%）4个因素，并进行了四因素三水平的响应面分析，响应面设计表如表2所示，最终确定胰蛋白酶酶解的最优条件。

表2 响应面实验因素表Table2 Design of factors and levels of esponse surface experiment

1.3.4 蛋白酶活力的测定

工业用酶通用方法，参照QB/T 1803-1993。

水解度的测定：运用甲醛滴定法，参照GB/T5009. 39-2003《酱油卫生标准的分析方法》。

DPPH自由基清除能力的测定：参照Qiang Zhao等[6]的方法。

·OH自由基清除能力的测定：参照林倩[7]的方法。

2 结果与分析

2.1 胃蛋白酶酶解效果

2.1.1 胃蛋白酶酶解时间对阿魏菇抗氧化多肽酶解效果的影响

以蛋白水解度和DPPH清除能力为指标，选择1、2、3、4 h 4个点考察胃蛋白酶酶解时间的影响。结果如图1所示。

图1 胃蛋白酶酶解时间对水解度和DPPH自由基清除能力的影响Fig.1 Theeffect of pepsin hydrolysis time on DH and DPPH radical scavenging capacity

由图1可知，水解度和DPPH清除能力均先随酶解时间的增加而升高，在3 h时都达到最大值，继续增加酶解时间，水解度增高缓慢，DPPH清除能力下降明显，选取最优酶解时间为3 h。

2.1.2 胃蛋白酶酶添加量对阿魏菇抗氧化多肽酶解效果的影响

考察了胃蛋白酶酶添加量2000、4000、6000、8 000、10 000U/g 5个点对水解度和DPPH清除能力的影响，结果如图2所示。

图2 胃蛋白酶酶添加量对水解度和DPPH自由基清除能力的影响Fig.2 The effect of pepsin dosage on DH and DPPH radical scavenging capacity

由图2可知，水解度随着酶添加量的增加呈上升趋势，在8000U/g时达到最大，继续增大都水解度降低，DPPH清除能力随酶添加量呈先增大后降低的趋势，在6 000U/g时达到最大，但6 000U/g与8 000U/g两点的DPPH清除能力相差不大，综合考虑，选择酶添加量8 000U/g为最优。

2.1.3 底物浓度对阿魏菇抗氧化多肽酶解效果的影响

将底物浓度设置为1%、2%、3%、4%、5%，分别考察蛋白水解度和水解液的DPPH自由基清除能力，结果如图3所示。

图3 底物浓度对水解度和DPPH自由基清除能力的影响Fig.3 The effect of concentration of substrate on DH and DPPH radical scavenging capacity

由图3可以看出，水解度随底物浓度的增加呈显著降低的趋势，而DPPH清除能力随底物浓度增加而增大，并且水解度由底物浓度1%～2%增加的过程降低显著，因此选择1%为最佳底物浓度。

2.1.4 pH对阿魏菇抗氧化多肽酶解效果的影响

根据胃蛋白酶标签最佳pH为1～3，故分别考察了pH 1、1.5、2、2.5、3五个梯度对蛋白水解度和DPPH清除能力，结果如图4所示。

由图4可知，水解度随着pH的增加而增大，在pH 2时达到了最大活性，能够水解最多的阿魏菇蛋白。并且DPPH也随的pH增加而增大，在pH为2.5时达到最大，与pH 2时相差不大，综合考虑，选择2为胃蛋白酶最适pH。

图4 pH对水解度和DPPH自由基清除能力的影响Fig.4 The effect of pH on DH and DPPH radical scavenging capacity

2.1.5 胃蛋白酶正交试验结果

在单因素的基础上，选取酶解时间、酶添加量、底物浓度、pH 4个因素，按照L9（34）设计正交试验，结果如表3所示。

表3 正交试验方案及结果分析L9（34）Tab le3 The scheme and results of orthogonal test analysis L9（34）

由表3可以看出，影响胃蛋白酶酶解阿魏菇蛋白水解度的因素的主次顺序为pH＞酶解时间＞底物浓度＞酶添加量，对于水解度，综合考虑各因素的K值和直观分析，酶解的最佳组合为酶解时间为1 h，酶添加量为8 000U/g，底物浓度0.5%，pH2。影响胃蛋白酶酶解阿魏菇蛋白DPPH清除能力的因素的主次顺序：底物浓度＞pH＞酶解时间＞酶添加量，通过直观分析，最佳组合：酶解时间2 h，酶添加量1000U/g，底物浓度1%，pH1.5。综合水解度和DPPH清除能力的影响效果，并以对水解度影响的效果为主，DPPH清除能力的效果为辅，最终确定的胃蛋白酶水解最优组合：酶解时间1 h，酶添加量8 000U/g，底物浓度1%，pH2。按此最佳工艺组合重复三次实验，胃蛋白酶水解阿魏菇蛋白的水解度为16.3%，DPPH清除能力为57.4%。最佳工艺较好的表明了该方案可行。

2.2 胰蛋白酶酶解效果

2.2.1 酶解时间的影响

酶解时间的影响如图5所示。

图5 胰蛋白酶酶解时间对水解度和·OH自由基清除能力的影响Fig.5 The effect of trypsin hydrolysis time on DH and·OH radical scavenging capacity

由图5可知，随着酶解时间的延长水解度先增加后趋于稳定，说明蛋白暴露的酶切位点充分被切开[8]。但随着时间的延长，·OH清除能力呈先增加后降低的趋势，可能是由于随着时间的增加将具有抗氧化的多肽进一步切断，使其失去抗氧化性，为了保证最优的抗氧化活性，选取酶解时间为1.5 h。

2.2.2 酶添加量的影响

酶添加量的影响如图6。

图6 胰蛋白酶酶添加量对水解度和·OH自由基清除能力的影响Fig.6 The effect of trypsin dosage on DH and·OH radical scavenging capacity

如图6所示，随着酶添加量的增大，蛋白水解度先增大后达到饱和，当底物浓度一定时，不断增大酶量会造成酶的浪费，增加成本。并且随着时间的延长·OH清除能力先增大后降低，可能是随着酶添加量的增大，使蛋白水解成小分子的多肽或氨基酸[9]，使具有抗氧化性的多肽量减少，抗氧化活性降低，因此选取酶添加量为8 000U/g为最优。

2.2.3 pH的影响

pH的影响如图7所示。

根据酶标签所示的pH适宜范围7.5～8.5，水解度和·OH清除能力都是随pH增大先升高后降低，因为每一种酶酶解物质时都有其最适的pH，在最适的pH时具有最高的活性[10]，根据变化趋势，pH8为胰蛋白酶的最适pH。

图7 pH对水解度和·OH自由基清除能力的影响Fig.7 The effect of pH on DH and·OH radical scavenging capacity

2.2.4 底物浓度的影响

底物浓度的影响如图8所示。

图8 底物浓度对水解度和·OH自由基清除能力的影响Fig.8 The effect of concentration of substrate on DH and·OH radical scavenging capacity

随着底物浓度的增加，水解度随之降低，可能是由于底物浓度越大，与酶的有效结合力越低，酶解的越不充分。·OH清除能力随底物浓度的增加先增大后降低，综合考虑选取底物浓度为1%为最优。

2.2.5 响应面试验结果分析

在单因素实验的基础上，选取酶解时间、酶添加量、pH、底物浓度4个因素，分别筛选3个水平进行响应面分析，以阿魏菇多肽清除·OH能力为响应值，探究胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白的最佳工艺参数。实验结果如表4所示。

表4 响应面试验设计与结果Table4 The design and results of response surface experiment

续表4 响应面试验设计与结果Continue table4 The design and results of response surface experiment

表5 回归方程显著性检验Table5 Significance check of the regression equation

通过Design Expert8.05软件分析，得出二次回归方程为：·OH清除能力 =74.16-5.93*A-1.95*B-3.41*C+7.01*D-0.7*A*B+0.56*A*C+1.11*A*D-1.81*B*C-0.36*B*D-5.02*C*D-18.83*A2-5.85*B2-8.85*C2-29.75*D2。

由表5的显著性方差分析[11]可知，模型的P＜0.000 1极显著，失拟项P=0.508 7＞0.05不显著。表明建立的该模型可以用来分析和预测胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白的工艺参数。回归方程的显著性分析表明，A、C、D、CD、A2、B2、C2、D2项显著，且回归方程的相关系数R2= 0.965 2，也是极显著的，因此可用回归方程代替试验真实点对结果进行分析。

根据回归方程绘制的响应面图，可以有效预测并检验变量的响应值同时确定各个变量之间的相互作用关系。分析底物浓度、pH的交互作用对·OH清除能力的影响，同时预测较优值。根据回归方程做出模型的响应曲面及其等高线见图9。

图9 pH与底物浓度交互作用等高线和响应面图Fig.9 Curved surface chartof pH and concentration of substrate

由图9可看出，底物浓度和pH之间的交互作用显著，底物浓度固定不变，·OH清除能力随着pH的增大先升高后降低，变化不显著。固定pH，随着底物浓度的增大，·OH清除能力呈现先升高后降低的趋势，且变化较显著。由等高线图可以直观的看出，在一定区域内存在较优值，在底物浓度1.5%，pH2左右，阿魏菇多肽的·OH清除能力达到最大值。

采用Design Expert8.05软件对实验模型进行分析，胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白制备抗氧化多肽的最优参数为酶解时间1.42 h，酶添加量7 744.93 U/g，pH 7.96，底物浓度1.35%，在此条件下·OH清除能力的理论值达到75.59%。在此条件下，实验重复三次，最终得到的·OH清除能力的平均值为74.7%，与理论值基本一致。结果表明，该模型可以较好地反映出胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白的条件，从而也证明了响应曲面法优化胰蛋白酶酶解阿魏菇蛋白条件参数的可行性。

3 结论

结合人体的消化系统，选取人体消化道内具有的胃蛋白酶和胰蛋白酶分步水解阿魏菇蛋白制备抗氧化多肽，在单因素的基础上确定了合适的因素水平，然后通过正交试验和响应面试验对条件进行优化。最终确定的胃蛋白酶酶解条件为：酶解时间1 h，酶添加量8 000U/g，底物浓度1%，pH2，再加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的酶解参数为：酶解时间1.42 h，酶添加量7 744.93U/g，pH7.96，底物浓度1.35%，最终的·OH清除能力为74.7%。由此可知，合理食用阿魏菇可以有效的清除体内的自由基，从而在一定程度上延缓衰老。

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Preparation of Antioxidant Peptides by Pepsin-trypsin Combined Enzymatic Hydrolysis from Pleurotus FerulaeLenzi

WANG Xue-ming，XU Cheng-jian*，NU Bo-nan，LU Shi-ling
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi832000，Xinjiang，China）

In order to establish the optimum conditions of preparation antioxidant peptides from Pleurotus Ferulae Lenzi protein，using pepsin and trypsin hydrolysis.The optimum technological conditions of pepsin hydrolysis were obtained by single factor and orthogonal array design methods，the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging capacity for response.The optimum conditions for pepsin hydrolysis method were as follows：hydrolysis time 1 h，enzyme dosage 8 000 U/g，substrate concentration 1%，pH2.On this basis，utilizing response surface for analysis of tryptic hydrolysis time，enzyme dosage，pH，substrate concentration，hydroxyl radical（·OH）as a response to determine the optimal conditions for tryptic hydrolysis as follows：hydrolysis time 1.42 h，enzyme dosage 7 744.93U/g，pH7.96，substrate concentration 1.35%，in this condition the·OH clearance was 74.7%，the relative error with the theoretical value 75.59%was less than 1%，indicating that that the model has a good fit of the experiment.

Pleurotus Ferulae Lenzi protein；antioxidant peptides；response surface analysis；the optimal conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.006

2014-08-27

国家自然科学基金项目（31101256）；石河子大学高层次人才科研启动项目（RCZX201021）

王雪铭（1990—），男（汉），在读研究生，研究方向：天然产物制备与功能活性研究。

*通信作者：许程剑（1978—），男（汉），副教授，博士，主要从事天然活性物质功能的研究。