微管相关蛋白1轻链3Ⅱ与微管相关蛋白2在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达

刘金霞，马原源，刘斌，邓春颖，李世英

微管相关蛋白1轻链3Ⅱ与微管相关蛋白2在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达

①刘金霞，马原源，刘斌，邓春颖，李世英

目的观察微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)与微管相关蛋白2(MAP-2)在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达及变化情况。方法48只Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组和模型组(血管性痴呆模型)，每组大鼠又随机分为模型制备成功后1、2、4和8周4个亚组，每个亚组6只。采用四血管阻断法制备大鼠血管性痴呆模型。免疫组化法检测LC3Ⅱ与MAP-2的表达。结果与假手术组比较，模型组各时间点LC3Ⅱ表达均显著增高(P＜0.001)，MAP-2表达均显著减少(P＜0.001)。模型组各时间点大鼠海马CA1区LC3Ⅱ与MAP-2的蛋白表达呈负相关(r=-0.723,P＜0.001)。结论LC3Ⅱ蛋白在海马CA1区过度表达，MAP-2蛋白表达减少，这可能是血管性痴呆发生、发展的重要机制之一。

血管性痴呆；微管相关蛋白1轻链3；微管相关蛋白2；海马；自噬；大鼠

[本文著录格式]刘金霞，马原源，刘斌，等.微管相关蛋白1轻链3Ⅱ与微管相关蛋白2在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达[J].中国康复理论与实践,2015,21(5):497-500.

CITED AS:Liu JX,Ma YY,Liu B,et al.Expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 II and microtubule-associated protein 2 in CA1 area of hippocampus of vascular dementia rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(5):497-500.

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由脑血管疾病导致的脑组织损害，造成脑功能减退的认知缺损综合征，是老年期痴呆的重要病因[1]。随着脑血管病发病率的不断升高，血管性痴呆的发病率日益增高，严重影响患者的生活质量[2-3]，给社会和家庭带来沉重的负担。随着研究的深入，学者提出了血管性痴呆发病机制的相关观点[4-6]，但其确切发病机制目前还不十分清楚。

自噬是指细胞在自噬相关基因的调控下，利用溶酶体、自噬泡降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程[7]，被称为Ⅱ型程序性死亡。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)

是在高等真核细胞中发现的第一种自噬体膜蛋白，是自噬的关键蛋白[8]，被广泛应用于检测哺乳动物中自噬活性和自噬体形成，通过检测细胞内LC3Ⅱ的量或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，可确定细胞自噬是被诱导还是被抑制状态[9]。微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)为微管相关蛋白家族，可在微管蛋白连接区连接微管，稳定细胞骨架，参与神经元可塑性调节，在突触改变过程中有重要作用[10]，并可稳定结构，传导信号，对神经元起保护作用[11]。本研究观察自噬相关蛋白LC3Ⅱ与MAP-2在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达，以探讨其在血管性痴呆发生、发展中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，2～3月龄，体重240～260 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK(京)2013-0013。在河北联合大学屏障环境动物实验室自由进食喂养，室温控制在(24±2)℃，自然光照。实验前适应喂养2周。

大鼠编号，用随机数生成器随机抽取数字，将大鼠分为假手术组和模型组，每组再分为造模后1、2、4、8周4个亚组，每个亚组6只。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗大鼠LC3Ⅱ多克隆抗体、兔抗大鼠MAP-2多克隆抗体和山羊血清封闭液：北京博奥森生物技术有限公司。柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。脑立体定位仪：NARISHIGE公司。Olympus光学显微镜：OLYMPUS公司。

1.3 模型制备

采用改良Pulsinelli四血管阻断法(4-VO)制备血管性痴呆大鼠模型[12]。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。模型组用电凝针烧灼双侧第1颈椎横突孔内的椎动脉，使双侧椎动脉永久性闭塞，然后缝合；分离双侧颈总动脉，穿线备用。24 h后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，每次夹闭5 min，间隔10 min，反复夹闭3次。发生全脑缺血的大鼠可观察到四肢及尾巴僵硬，甚至出现尾巴向上强直卷曲，翻正反射消失。假手术组只暴露双侧颈总动脉及第1颈椎横突孔，然后缝合，不进行椎动脉电凝及颈总动脉的夹闭。手术后，大鼠均予庆大霉素2 mg/kg腹内注射3 d，以预防感染。

1.4 标本制备

按预定时间点取材。大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，仰卧固定于操作台上，剑突下剪开胸腔，充分暴露心脏。将灌注针从心尖插入至左心室并固定针尖位置，然后剪开右心耳，注射生理盐水约250 ml；待大鼠肝脏无明显血色、右心耳流出无色液体后，灌注4%多聚甲醛约180 ml，可见大鼠肢体抽动、尾巴僵直。快速断脑，迅速剥离脑组织置于盛有多聚甲醛的瓶中，4℃冰箱放置24～36 h后，切取视交叉前后3 mm脑组织脱水、透明、浸蜡、包埋。石蜡切片机连续切片，厚约3 μm，用经泡酸、冲水、烤干、多聚赖氨酸溶液处理后的载玻片捞片，晾干后置于60℃烤箱中24～36 h备用。

1.5 LC3Ⅱ和MAP-2蛋白检测

按SP试剂说明书进行操作。兔抗大鼠LC3Ⅱ多克隆抗体及兔抗大鼠MAP-2多克隆抗体均稀释至1∶300。高倍镜下随机选取大鼠海马CA1区6个视野，进行阳性细胞计数，计算平均数。

1.6 统计学分析

2 结果

假手术组海马CA1区各时间点可见少量LC3Ⅱ蛋白阳性表达。模型组1周时可见LC3Ⅱ蛋白阳性表达，随着时间的延长逐渐增强，4周达到高峰，8周开始下降，但仍较高。与假手术组相比，模型组各时间点LC3Ⅱ蛋白阳性细胞数均显著增高(P＜0.001)。见表1、图1。

假手术组海马CA1区各时间点可见多量MAP-2蛋白阳性表达。模型组1周时可见MAP-2蛋白阳性表达，4周表达最高，8周开始下降，但仍较高。与假手术组相比，模型组各时间点MAP-2蛋白阳性细胞数均显著减少(P＜0.001)。见表1、图2。

模型组各时间点大鼠海马CA1区LC3Ⅱ与MAP-2蛋白表达呈明显负相关(r=-0.723,P＜0.01)。

表1 各组大鼠海马CA1区各时间点LC3Ⅱ、MAP-2蛋白表达(/高倍视野)

图1 各组海马CA1区各时间点LC3Ⅱ蛋白表达(免疫组化，400×)

图2 各组海马CA1区各时间点MAP-2蛋白表达(免疫组化，400×)

3 讨论

血管性痴呆发病机制的研究是近年研究的热点。研究者针对血管性痴呆的发病提出血管机制、胆碱能系统受损机制、兴奋性氨基酸细胞毒性机制、炎性反应机制、自由基损伤机制及突触可塑性机制等观点[13-14]。我们的先前研究表明，自噬参与血管性痴呆的发生过程[15-16]。自噬是一种由溶酶体介导的降解过程，在维持细胞内物质的合成、降解平衡和细胞成分的有序再利用中发挥重要作用[17]。在营养匮乏或疾病状态下，自噬可被激活，出现特征性的具有双层膜结构的自噬体。自噬体通过微管系统运输至溶酶体并融合形成自噬溶酶体，进行多种酶消化及降解过程，降解产物释放入胞浆并被细胞再利用[18]。

LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型。在自噬发生过程中，Ⅰ型LC3主要存在于细胞质中，经泛素样加工修饰，与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成Ⅱ型LC3并聚集到自噬体膜上[19]。它们在膜上的含量通常被作为测定自噬活性的方法[20]。自噬过度激活可导致神经细胞死亡，属于自噬性细胞死亡[21]。在血管性痴呆的发病中，自噬与凋亡共存，且两者表达趋势一致[22]。本研究结果显示，血管性痴呆模型大鼠海马CA1区不同时间点LC3Ⅱ表达明显增加，说明自噬参与血管性痴呆的发生、发展过程。

MAP-2是神经元的一种骨架蛋白，主要存在于神经细胞的树突和胞体中。MAP-2作为突触后的标志蛋白，在调节突触可塑性方面起着重要作用[23]。突触建立后，蛋白磷酸化酶激活和/或蛋白激酶抑制，使MAP-2去磷酸化，MAP-2与微管相连，细胞骨架稳定，保持突触结构的稳定性[24]。大鼠大脑中动脉闭塞后再灌注7 d左右，MAP-2蛋白表达下降[25]。本研究显示，血管性痴呆模型大鼠海马CA1区各时间点MAP-2蛋白表达均低于假手术组，与文献报道的结果一致[26]。MAP-2在缺血性损伤的表达下调，使微管稳定性受损，导致不可逆的神经元损伤。MAP-2在血管性痴呆的发生、发展过程中也起重要作用。

本研究还显示，LC3Ⅱ和MAP-2的表达呈负相关，提示自噬可以调节病理状态下神经突触的可塑性，这可能是血管性痴呆发生、发展的重要机制之一。血管性痴呆大鼠发生自噬的同时，出现神经元细胞骨架稳定性降低，两者之间可能存在复杂的联系。对两者的深入研究，有助于揭示血管性痴呆发生发展过程的内在机制，为血管性痴呆发病机制的研究和治疗提供新的理论依据。

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Expression of Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3 II and Microtubule-associated Protein 2 in CA1 Area of Hippocampus of Vascular Dementia Rats

LIU Jin-xia,MA Yuan-yuan,LIU Bin,DENG Chun-ying,LI Shi-ying
First Department of Neurology,theAffiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China

Objective To observe the expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 II(LC3II)and microtubule-associated protein 2(MAP-2)in CA1 area of hippocampus in vascular dementia rats.Methods 48 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group and model group.Meanwhile,each group was further divided into 1,2,4 and 8 weeks subgroups(n=6).Vascular dementia model was established by blocking four vessels.The expressions of LC3II and MAP-2 protein were detected with immunohistochemistry in the CA1 area of hippocampus.Results The expression of LC3II significantly increased,and the expression of MAP-2 decreased in the model group compared with the sham group at every time point(P＜0.001).The expression of LC3II was negatively correlated with MAP-2 at every time point in the model group(r=-0.723,P＜0.05).Conclusion It may play an important role for the occurrence and development of vascular dementia that the expression of LC3II increased and MAP-2 descreased in CA1 area of hippocampus in rats.

vascular dementia;microtubule-associated protein 1 light chain 3;microtubule-associated protein 2;hippocampus;autophagy;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.001

R749.1

A

1006-9771(2015)05-0497-04

2015-01-27

2015-02-16)

1.河北省高等学校科学技术研究重点项目(No.ZH2012046)；2.河北省重大医学科研课题(No.zd2013087)。

河北联合大学附属医院神经内一科，河北唐山市063000。作者简介：刘金霞(1989-)，女，汉族，河北保定市人，硕士研究生，主要研究方向：脑血管病及认知障碍。通讯作者：刘斌，男，硕士，主任医师，教授，研究生导师。E-mail:liubintsh@126.com。