一年二十四节气中新鲜与阴干黄芩根黄酮类成分含量对比及其相关性

周安莉，冯小艳，周国军，李 焱，周铜水

(复旦大学生命科学学院及天然药物研究中心，上海 200438)

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是唇形科黄芩属多年生草本植物，传统以干燥根入药，为我国历史悠久的大宗药材。黄芩性寒味苦，具有清热燥湿，泻火解毒，止血安胎等功效，常用于湿温、暑湿，胸闷呕恶，肺热咳嗽，高热烦渴，胎动不安等症［1］。黄芩的主要活性成分是黄酮类化合物，以黄芩苷(baicalin)、汉黄芩苷(wogonoside)、黄芩素(baicalein)和汉黄芩素(wogonin)为主［2］。这些成分具有抗癌、抗菌抗病毒、抗氧化、抗炎、降糖降脂、保护心脑血管及神经元等作用［3－5］。《中国药典》以黄芩苷作为评价黄芩药材质量的指标，规定其干燥品含量不得低于 9%［1］。

目前，针对各产地种植黄芩的最佳采收年限、最佳采收季节，以及黄芩中各种黄酮类成分的动态变化规律已有诸多报道［6－8］。但多数实验只针对传统采收期即春、秋两季，进行数月、最长不超过半年的连续研究，且基本上仅关注干燥的黄芩药材。对于连续一年二十四节气生长过程中黄酮类成分的动态变化，尚无研究报道。此外，本实验室前期研究发现，黄芩根的黄酮类成分与丹参的化学成分一样，主要也是在采后干燥过程中产生的［9－12］，对于不同产地丹参药材的分析结果都得出同样结论［13］。本文旨在进一步探讨:(1)一年二十四节气黄芩根中黄酮类成分是否都是在阴干过程中产生的;(2)干燥根中黄酮类成分含量与新鲜根中原有成分含量的相关性;(3)一年二十四节气中苷、苷元的消长变化规律。研究结果为进一步证实采后干燥诱导丹参、黄芩等根类药材活性成分的产生，以及阐述黄芩中黄酮类成分的形成与转化机制提供更充分依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂 Agilent 1100系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司，配置有G1361A二元高压梯度泵，G1322A在线脱气机，G1315B二极管阵列检测器，ChemStation化学工作站);Agilent Zorbax SB－C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);DL－180A型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司);BP110S型电子天平(Sartorius);红外线快速水分测定仪(深圳市冠亚电子科技有限公司)。

色谱纯三氟乙酸购自国药集团化学试剂有限公司;色谱纯乙腈购自百灵威科技有限公司;水为双蒸水;其余均为国产分析纯试剂。对照品黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素购自上海友思生物科技有限公司，纯度均大于98%。

1.2 实验材料 新鲜黄芩根自2013年5月(移栽苗)至2014年5月连续一年按照节气采收(表1)。所有新鲜样品在采收地立即进行如下处理:洗尽泥沙，一部分立即冷藏于－20℃冰箱中，另一部分以整株状态悬挂于阴凉处阴干1个月(室内自然温度5～30℃，湿度25% ～70%)。各季度样品带回实验室后保持原有状态，直至测试。所有样品于测定前经液氮冷冻后粉碎。取样品粉末，一部分用于水分测定，并根据水分含量折算粉末干重;另一部分用于测定黄酮类成分含量，各样品重复分析3次。

表1 2013—2014年二十四节气及样品采收时间

2 实验方法

2.1 样品水分含量测定 黄芩根样品含水量测定利用红外线快速水分测定仪完成。每份样品重复3次。

2.2 黄酮类成分含量测定 采用本实验室已报道的方法［12］。各成分的线性回归方程分别为黄芩苷:Y=38.30X－14.09;汉黄芩苷:Y=52.98X+13.95;黄芩素:Y=55.79X－39.15;汉黄芩素:Y=74.22X+7.763。相关系数 r均大于0.999，线性范围依次为:0.51 ～164、0.33 ～104、0.24 ～76、0.31 ～100 mg·L－1。对该含量测定方法的日间精密度、日内精密度、稳定性、重复性以及加样回收率等进行了系统方法学考察，结果RSD值均小于5%，表明该方法稳定、可靠，可用于黄芩药材的质量分析研究［12］。样品含量测定:精密称取干重0.2 g的黄芩根样品粉末，加入15 mL 70%乙醇，超声处理30 min，5 000 r·min－1离心 10 min，上清倒入 50 mL 容量瓶;重复用70%乙醇提取一次，合并上清到50 mL容量瓶，70%乙醇定容至50 mL，用0.22μm微孔滤膜过滤即得供试品溶液。按上述HPLC方法测定4种黄酮类成分的含量，每份样品重复实验3次［12］。

2.3 数据处理与统计分析 数据处理用Microsoft Excel软件完成;图表制作利用 SigmaPlot 11.0完成。数据间显著性、相关性与回归分析利用SPSS 19.0软件完成。

3 结果

3.1 新鲜与阴干黄芩根中水分含量变化 新鲜及阴干根样品的含水量如图1A所示，由于种植地天气变化、黄芩生长状态变化等导致新鲜根中的含水量有一定波动。整体来看，夏、春两季的新鲜根含水量较高，平均分别为65.13%和61.39%;秋、冬两季较低，平均分别为51.17%和54.00%。在大暑(2013年7月22日)当日新鲜根含水量达全年峰值，为(68.28±1.67)%。而在立秋(2013年8月7日)过后含水量迅速下降，至白露(2013年9月7日)时含水量仅为(47.98±1.85)%，之后新鲜根中含水量波动较为平缓，全年最低值出现在立冬(2013年11月7日)，为(47.12±0.55)%。而阴干后黄芩根中含水量较新鲜均大大降低，范围为(9.00±0.32)% ～ (15.53 ±0.64)%，平均值为12.60%。

3.2 新鲜及阴干黄芩根中苷类成分和总黄酮的变化 二十四节气新鲜和阴干黄芩根中的苷类成分及四种黄酮总量(简称总黄酮)的变化如图1B～E所示。对比新鲜与阴干根中的总苷类成分(图1B)可发现，除22(清明)和23号(谷雨)两样品外，阴干后根中的总苷含量均有极显著增加(P＜0.01)。一年二十四节气新鲜根总苷含量变化范围为(37.68 ±2.18)～(169.59 ±6.52)mg·g－1，平均值为99.56 mg·g－1;阴干根变化范围为(108.95 ±6.44)～ (260.68 ± 13.19)mg·g－1，平均值为181.19 mg·g－1，增加了近 1 倍。尤其是 1 号样品(小满)新鲜根的总苷含量仅为(39.78±4.66)mg·g－1，阴干后增加近 4 倍，达(190.47 ±12.57)mg·g－1。而新鲜与阴干根中的黄芩苷含量变化与总苷基本一致(图1C)，即阴干根中的黄芩苷含量较新鲜根有极显著增加(P＜0.01)。这是因为黄芩苷是主要的苷类成分，一般占总苷七成以上。新鲜根黄芩苷含量为(22.35 ±1.01)～(137.85 ±7.78)mg·g－1，平均值 75.46 mg·g－1;阴干根黄芩苷含量为(87.92 ±5.15)～ (216.87 ±10.18)mg·g－1，平均值151.48 mg·g－1。汉黄芩苷在新鲜根与阴干根中的含量差异并不明显(图1D)，阴干处理未使其呈现有规律的增高或降低。

阴干处理后大部分节气中总黄酮含量亦明显上升(图1E)，但增幅没有总苷含量显著。新鲜根总黄酮含量为(118.02±11.22)～(224.52 ±4.40)mg·g－1，平均值 165.74 mg·g－1;阴干根总黄酮含量为(159.38 ±8.57)～ (283.95 ±14.70)mg·g－1，平均值 210.89 mg·g－1，较新鲜根中增加 27.24%。

3.3 新鲜及阴干黄芩根中苷元类成分变化 与总苷相反，阴干处理后根中总苷元含量基本上均有极显著降低(图2A)。一年二十四节气的新鲜根总苷元含量变化范围为(34.47±2.96)～(89.53±13.46)mg·g－1，平均值为 66.19 mg·g－1;而阴干根中为(11.6 ±0.62)～(71.19 ±6.77)mg·g－1，平均值为29.70 mg·g－1，减少超一半。黄芩素含量在新鲜与阴干根中的变化与总苷元类似(图2B)，且减少得更加明显。一年二十四节气中，新鲜根黄芩素含量为(31.69 ±2.64)～ (74.45 ±1.48)mg·g－1，平均值 57.91 mg·g－1;阴干根黄芩素含量为(10.25 ±0.76)～ (54.93 ±5.45)mg·g－1，平均值24.10 mg·g－1。而汉黄芩素含量在新鲜与阴干根中变化无明显规律(图2C)。

3.4 新鲜与阴干黄芩根中苷元与苷类成分的比值变化 新鲜根的总苷元/总苷及黄芩素/黄芩苷数值变化范围分别为 0.27 ～2.36 及 0.30 ～3.12，说明在新鲜根中黄芩苷与黄芩素含量并没有太明显的差距。而经过阴干处理后，总苷元/总苷及黄芩素/黄芩苷的数值都明显降低，且明显小于1，变化范围分别为 0.06 ～0.57 及 0.06 ～0.53，即阴干根中黄芩素含量基本不足黄芩苷的一半。汉黄芩素与汉黄芩苷的比值则波动更大，新鲜根与阴干根中也没有明显的区别，基本上均＜1。说明无论在新鲜还是阴干样品中，汉黄芩素含量均少于汉黄芩苷含量。

3.5 阴干与新鲜黄芩根中黄酮类成分含量变化相关性分析 相关性分析结果表明，无论是在新鲜根还是阴干根中，黄芩苷与汉黄芩苷均呈极显著的正相关(P＜0.01)，而与黄芩素，汉黄芩素均呈极显著的负相关性。值得注意的是，阴干根中四种黄酮类成分含量变化与新鲜根中相关成分的原有含量没有相关性，说明阴干样品中黄芩苷(总苷)成分的增加不是由新鲜样品中的相关成分直接转化而来。

4 讨论

本实验自2013年5月开始，连续一年对山东栽培黄芩的新鲜及阴干根中四种黄酮类成分变化进行了追踪、分析和比较。其中，黄芩苷是中药黄芩中含量最多、最主要的活性成分，也是我们关注的重点。一年二十四节气中，新鲜黄芩根中的黄芩苷含量多数时候难以达到药典的要求，而阴干处理后黄芩苷含量显著增加，基本上均能大大超过药典的要求，有些甚至能超过药典规定的两倍，与本实验室前期结果有一致性［12］。总苷及总黄酮含量亦增加明显，黄芩素和总苷元含量则显著降低，阴干处理后黄芩素含量基本不足黄芩苷的一半。实验证实了黄芩根的黄酮苷类成分与丹参的活性成分丹酚酸B类似［9］，主要也是在采后干燥胁迫过程中产生。这是因为植物的次生代谢产物通常是水份、温度、虫害等环境胁迫的产物，干燥过程对于新鲜采收的植物体尤其根来说，事实上就是一个干旱胁迫的过程，可能诱导活性成分的大量形成和升高［14］。这些研究结果和发现对于中药材GAP生产具有重要的理论和应用价值［9］。

对于四种黄酮类成分含量进行相关性分析可发现，新鲜和阴干根中黄芩苷均与汉黄芩苷呈极显著正相关，而与黄芩素及汉黄芩素呈极显著负相关。但是阴干根中四种黄酮类成分的含量变化与新鲜根中原有黄酮类成分含量没有相关性，亦即干燥过程中黄芩苷类成分的增加不是由新鲜植物体中黄芩素等苷元成分直接转化而来。这一结果与我们先前报道的“在黄芩新鲜样品、黄芩苷持续上升的早期干燥阶段、以及黄芩苷下降的后期干燥阶段，都没有检测到高含量的黄芩苷合成必要的前体和降解产物黄芩素的存在”的结果完全一致［9］。推测干燥早期阶段黄芩苷的形成可能是由黄芩根中淀粉、糖等储备营养成分为抵御干燥胁迫而重新启动和转化而来，而在干燥后期黄芩苷降解形成的黄芩素即刻被用于抗氧化而快速消耗［9］。这方面的研究工作正在研究过程中。

本实验证实在一年二十四节气中，阴干处理都导致有效成分黄芩苷含量的显著上升以及黄芩素含量的显著下降，且阴干根中黄酮苷类成分的含量增加与新鲜根中原有成分的含量无相关性。该研究结果为我们发现的采后干燥是根类药材活性成分形成和积累的关键时期这一结论提供了新的证据，也为优质黄芩药材的GAP生产提供重要参考。有关新鲜及阴干黄芩中黄酮类成分的动态变化与气候因子的相关性分析，将另文讨论。

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