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芦丁对大鼠胃缺血再灌注损伤的保护作用

2015-12-13王志东

安徽医药 2015年8期
关键词:胃壁芦丁黏液

王志东,高 峰

(潍坊医学院药理学教研室,山东潍坊 261053)

随着对胃缺血再灌注损伤病理生理机制研究的不断深入,近年来一氧化氮(NO)在胃黏膜病变过程中的作用日益受到关注[1-2]。芦丁属于黄酮类化合物,以往研究表明[3],芦丁对炎症引起的NO过量生成具有抑制作用。此外,有资料提示[4]芦丁对冷冻—束缚应激引起的胃黏膜损伤具有保护作用。然而,芦丁对胃缺血再灌注损伤的保护作用,国内外尚未见文献报道。本实验以大鼠胃缺血再灌注损伤模型研究芦丁对胃黏膜的保护作用,用光镜观察再灌注损伤后大鼠胃黏膜组织形态学的变化,并测定胃黏膜组织中髓过氧化物氧化酶 (myeloperoxidase,MPO)活性及胃壁黏液和NO的含量,同时对胃黏膜组织中丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、总NOS(TNOS)、诱导型(iNOS)和结构型 NOS(cNOS)活性进行了测定,以探讨芦丁对大鼠胃缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 药品和试剂 芦丁:Sigma公司,实验前用蒸馏水溶解。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号A001-1)、总丙二醛(MOD)测试盒(批号 A003-1)、一氧化氮(NO)试剂盒(批号 A012)、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(批号A014-1)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒(批号 A044)、苏木素伊红 (HE)染色试剂盒(批号D005-1,D019-1)(均为南京建成生物工程研究所)。其他均为AR级化学试剂。

1.2 实验仪器 高速匀浆机:上海弗鲁克流体机械制造有限公司;751G-可见紫外分光光度计:上海分析仪器厂;IX71光学显微镜:日本奥林巴斯光学工业株式会社。

1.3 实验动物和分组 普通级,♂,SD大鼠,体质量220~240 g(潍坊医学院实验动物中心提供)。实验前24 h禁食,自由饮水,室温 (23±2)℃。将SD大鼠随机分为5组:假手术组、缺血再灌注组、芦丁高剂量组、芦丁中剂量组、芦丁低剂量组。芦丁用生理盐水稀释,给药组分别灌胃给予3种不同剂量芦丁 (50、100、200 mg·kg-1),连续 5 d,大鼠于末次给药前24 h禁食,末次给药后60 min实施胃缺血再灌注。

1.4 胃黏膜损伤模型制备及胃黏膜损伤指数测定采用Zhang等[5]方法,用动脉夹夹闭大鼠腹腔动脉30 min,再灌注1 h以制备大鼠缺血再灌注(GI/R)损伤模型。大鼠麻醉,打开腹腔沿胃大弯处剪开,用冰冷的生理盐水冲洗,在冰盘上展开,置方格计数板(每一方格面积为1 mm2),以局限于胃腺上皮的点状糜烂、溃疡和出血灶的长度累计积分:正常为0分,损伤≤1 mm计1分,≤2 mm计2分,其余类推;损伤宽度超过1 mm时加倍积分,每组大鼠损伤指数的平均值作为改组胃黏膜损伤指数 (gastric mucosal damage index,GMDI)。

1.5 苏木素—伊红染色观察胃黏膜的损伤 测量完损伤指数的胃,于冰盘上剪开,一半腺胃置于-80℃保存待用;一半腺胃置于4%多聚甲醛中固定后,乙醇脱水后用石蜡包埋,5μm切片,HE染色,于显微镜下观察病理改变。采用双盲法,在O-lympus光学显微镜下观察胃组织形态学变化。

1.6 生化指标的检测 取胃黏膜于冷生理盐水中匀浆,按试剂盒方法进行操作,检测SOD、cNOS、iNOS、TNOS、MPO活性及MDA含量。

1.7 胃壁黏液测定 按Bolton等[6]的阿利新蓝法测定胃壁结合黏液。大鼠缺血再灌注后,取胃,沿胃大弯剪开后将胃黏膜外翻,浸入阿利新蓝中室温放置2 h将胃取出,染液离心后,取上清液在751G-可见紫外分光光度计上于650 nm波长条件下比色,计算染料结合量。

2 结果

2.1 芦丁对大鼠缺血再灌注胃黏膜损伤的影响肉眼观察显示:假手术组动物胃黏膜完好;而缺血再灌注组动物胃黏膜损伤严重,可见点状、条索状和片状缺损,即溃疡形成,溃疡面有出血现象,胃黏膜损伤指数明显高于对照组 (P<0.001);与缺血再灌注组相比,芦丁低、中、高剂量组动物的胃黏膜损伤均明显减轻(P <0.001或P <0.01),结果见表1。

表1 芦丁对大鼠缺血再灌注胃黏膜损伤的影响(±s n=8)

表1 芦丁对大鼠缺血再灌注胃黏膜损伤的影响(±s n=8)

注:***P < 0.001,vs假手术组;##P < 0.01,###P < 0.001,vs缺血再灌注组。

组别 给药剂量/mg·kg-1胃黏膜损伤指数假手术组 —2.2 ± 2.1缺血再灌注组 — 132.1 ± 31.3***芦丁低剂量组 50 76.9 ± 11.6##芦丁中剂量组 100 43.7 ± 23.4###芦丁高剂量组 200 12.1 ± 8.3###

2.2 HE染色 假手术组胃黏膜未发现有病理学变化(图1A);显微镜下观察发现缺血再灌注组胃黏膜有胃黏膜糜烂、出血,局部腺体结构紊乱,间隙扩大,并有局部胃黏膜细胞脱落(图1B);芦丁高剂量组上皮基本完整、连续,腺体排列较整齐;胃黏膜充血较轻微(图1C)。

2.3 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影响 如表2所示,缺血再灌注组在缺血再灌注后,胃黏膜组织中MDA和NO的含量较假手术组明显升高(P<0.001);SOD活力降低显著(P<0.001)。与缺血再灌注组比较,芦丁低、中、高剂量组显著降低受损胃黏膜组织中的MDA和NO的含量,同时显著升高其SOD活力,结果见表2。

表2 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影响(±s,n=8)

表2 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影响(±s,n=8)

注:***P < 0.001,vs假手术组;#P < 0.05,##P < 0.01,###P < 0.001,vs缺血再灌注组。

组别 给药剂量/mg·kg-1 SOD/U·mg-1 NO/μmol·g-1 MDA/nmol·(mg prot)-1假手术组 —167.30 ± 31.35 3.87 ± 1.08 2.50 ± 0.77缺血再灌注组 — 106.20 ± 29.63*** 6.64 ± 1.73*** 6.31 ± 1.62***芦丁低剂量组 50 126.47 ± 29.02 5.25 ± 1.19# 4.72 ± 1.11#芦丁中剂量组 100 143.64 ± 29.61# 4.82 ± 1.21## 3.68 ± 1.03##芦丁高剂量组 200 153.50 ± 24.59## 4.23 ± 0.87## 2.91 ± 1.54###

2.4 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影响 缺血再灌注组大鼠缺血再灌注后,胃黏膜组织中MPO活性较假手术组显著升高(P<0.001)。与缺血再灌注组相比较,芦丁低、中、高剂量组明显地降低了大鼠胃黏膜组织MPO活性(P<0.001),见表3。

表3 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影响(±s,n=8)

表3 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影响(±s,n=8)

注:***P < 0.001,vs假手术组;###P < 0.001,vs缺血再灌注组。

组别 给药剂量/mg·kg-1 MPO/U·g -1假手术组 —2.73 ± 0.57缺血再灌注组 — 6.64 ± 1.38***芦丁低剂量组 50 3.31 ± 1.23###芦丁中剂量组 100 2.93 ± 0.65###芦丁高剂量组 200 2.21 ± 0.62###

2.5 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜组织NOS活性的影响 缺血再灌注组大鼠胃黏膜组织TNOS及iNOS活性明显高于假手术组(P<0.001),cNOS活性明显低于假手术组(P<0.05)。缺血前给予芦丁明显降低了TNOS活性和iNOS活性,并显著地增加了cNOS活性,结果见表4。

表4 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜组织NOS活性的影响(±s,n=8)

表4 芦丁对大鼠缺血再灌注后胃黏膜组织NOS活性的影响(±s,n=8)

注:*P < 0.05,*** P < 0.001,vs假手术组;#P < 0.05,##P < 0.01,###P < 0.001,vs缺血再灌注组。

组别 给药剂量/mg·kg-1 TNOS活性/U·mg-1 iNOS活性/U·mg-1 cNOS活性/U·mg -1假手术组 —2.53 ± 0.62 0.06 ± 0.02 2.47 ± 0.58缺血再灌注组 — 4.99 ± 1.11*** 3.25 ± 1.95*** 1.53 ± 0.52*芦丁低剂量组 50 3.89 ± 0.51## 1.74 ± 0.52### 2.29 ± 0.52#芦丁中剂量组 100 3.42 ± 0.55### 0.93 ± 0.71### 2.54 ± 0.55#芦丁高剂量组 200 2.89 ± 0.72### 0.53 ± 0.33### 2.45 ± 0.77#

2.6 芦丁对胃黏液分泌的影响 与假手术组比较,缺血再灌注组胃壁黏液结合量明显降低;与缺血再灌注组比较,芦丁高剂量组胃壁黏液结合量明显升高,差异有显著性(P<0.05),结果见表5。

表5 芦丁对胃黏液分泌的影响(±s,n=8)

表5 芦丁对胃黏液分泌的影响(±s,n=8)

注:** P < 0.01,vs假手术组;#P < 0.05,vs缺血再灌注组。

组别 给药剂量/mg·kg-1胃黏液/mg假手术组 —3.27 ± 0.79缺血再灌注组 — 1.92 ±0.98**芦丁低剂量组 50 2.08 ± 0.64芦丁中剂量组 100 2.49 ± 0.82芦丁高剂量组 200 2.93 ± 0.95#

3 讨论

缺血再灌注损伤特别是胃缺血再灌注损伤,是各种术后并发症、合并症的首要诱因,严重威胁了人类的健康。NO是由以L-精氨酸为底物在一氧化氮合酶(NOS)的催化下生成的一种重要的生物活性物质。研究证明,NOS在胃肠道广泛存在,根据NOS来源和对钙、钙调蛋白(Ca2+/CaM)依赖性的不同以及是否受内毒素、细胞因子诱导等特点,NOS分为组成型NOS(constitutive NOS,cNOS)和iNOS近年来,cNOS又分为神经型nNOS和 eNOS(endothelial NOS,eNOS)。

多年来研究认为,NO是一种重要的胃黏膜保护因子,文献报道其胃黏膜保护活性与其增加胃黏膜血流量有关[7]。然而,近年研究[2,8]显示 NO 在胃GI/R时具有双重功能,既有胃黏膜保护作用又有细胞毒作用。Gou等[1]研究发现大鼠胃缺血再灌注时胃黏膜组织中NO含量明显增高,并发现缺血再灌注导致NO水平增加是由于胃黏膜组织中iNOS活性增高,造成NO水平快速升高,此时过度表达的NO可直接引起细胞毒作用或通过自由基氧化生成毒性更大的强氧化剂,从而导致能量代谢障碍使细胞死亡。因此,以NO的代谢为治疗靶点,寻找疗效更好的胃黏膜损伤治疗药物,具有重要的研究价值。

已有文献报道[3],芦丁具有减轻冷冻—束缚应激引起的胃黏膜损伤效应[4],且胃黏膜保护作用与其抗氧化应激活性有关。研究表明[3],芦丁对炎症引起的NO过量生成具有抑制作用。本实验结果显示,芦丁预处理可以降低大鼠GI/R损伤,抑制胃黏膜中TNOS和iNOS的活性增加,增加cNOS活性,降低胃黏膜组织MDA和NO含量;同时,研究发现芦丁降低了胃黏膜组织中MPO活性,减少淋巴细胞对胃黏膜组织浸润,减轻胃黏膜损伤。由此推断,芦丁可以抑制大鼠GI/R引起的胃黏膜组织氧化应激。此外,本研究表明,芦丁可通过抑制胃黏膜TNOS和iNOS的活性增加,上调cNOS活性调节NO的生成,进而抑制淋巴细胞在胃黏膜组织中浸润,发挥胃黏膜损伤治疗作用。

有资料表明[9],胃黏液分泌减少也是胃缺血再灌注导致胃黏膜损伤的一个重要诱因。胃黏液系胃黏膜表面覆盖着的一层具有黏弹性和水不溶性的黏液凝胶,其主要成分为高分子量的黏蛋白,而cNOS来源的NO可调节黏液细胞的功能,促进胃黏液的分泌[10]。本文对胃壁黏液的含量也进行了检测,结果发现,缺血再灌注组胃壁黏液较正常对照组含量有显著减少,这与以前的报道相一致[10];而芦丁可以显著增加胃黏液的含量,以增强润滑与保护胃黏膜免遭机械损伤的作用;同时,由于该黏液的黏滞性,使H+在黏液中的扩散速度减慢,从而加强屏障作用。此外,芦丁可以上调胃黏膜组织cNOS活性。本文推测,芦丁增加胃黏液的含量可能与上调胃黏膜中cNOS活性,以致cNOS来源的NO的生成增加,进而导致促进胃黏液的合成与分泌。然而其具体机制,有待进一步的研究。

综上所述,芦丁对大鼠GI/R损伤胃黏膜具有保护作用,其保护作用的机制调节胃黏膜组织中cNOS/iNOS的活性,调节NO的生成,从而减轻淋巴细胞组织浸润和促进胃壁黏液分泌有关。

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