芸香宁碱抑制血管生成作用的研究

华 慧，李 增

(芜湖市第一人民医院药剂科，安徽芜湖 241000)

血管生成是指在已经形成的血管结构基础上通过芽生或套叠式的方式生成新的血管过程，是一种动态而又协调的复杂过程。这一过程主要包括血管内皮细胞、基质细胞的增殖、迁移、分化，及后续的血管管腔化，整个血管生成的动态过程中受到多种血管生成因子和血管生成抑制因子的联合调控［1］。而在肿瘤的发生发展过程中，新生血管能够为肿瘤生长提供必需的养料，构成肿瘤生长的物质基础，并为肿瘤浸润、转移和扩散提供必备的条件［2－4］。因此，目前临床上，通过抑制肿瘤血管生成，从而进一步抑制肿瘤生长、扩散与转移，目前已成为转移性肿瘤治疗的一个重要的策略。Folkman［1］针对性地提出了抗血管增生药物作用的3种机制:(1)能阻断血管生成因子的表达、产生或输出，从而抑制血管基因表型的启动;(2)当血管生成因子已被吞噬细胞、肿瘤细胞或细胞外基质释放后，能立即予以灭活，如通过抗体与bFGF的相互作用使其灭活;(3)防止血管内皮细胞增殖和迁移，使内皮细胞对血管生成因子的刺激丧失应答能力［5］。根据这3种机制，以及血管生成的各个信号调控环节及其发生过程中的生化改变为靶点，现代的血管生成抑制剂的研究主要有如下5种策略:(1)阻断血管生成因子的表达;(2)阻断内皮细胞降解周围基质的能力;(3)直接抑制内皮细胞的功能;(4)阻断血管生成因子的合成和释放，拮抗其作用;(5)阻断内皮细胞表面整合素的作用［6－9］。

近年来研究发现，新生血管小分子抑制剂具有以下结构特征［10－12］:(1)有两个芳香基团;(2)其中一个芳香基团上有一个或者多个可以形成氢键的受体;(3)两个芳香基团有一个linker键连接。芸香宁碱(Graveolinine)(结构如图1所示)结构则符合上述特征。芸香宁碱属于2-苯基喹啉类化合物，广泛存在芸香科植物中。研究表明，芸香宁碱有解除平滑肌痊挛的作用(以氯化钡引起离体兔回肠的痉挛)，有抗炎症作用(MIC=16 mg·L－1)及抗组胺作用。进一步研究发现此类化合物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用［13］。但这一类化合物对新生血管生成的抑制作用及这一作用于它的抗肿瘤作用是否有关目前尚不清楚。因此在抑制肿瘤细胞增殖的作用的基础上，本研究通过以下几个方面综合评价了芸香宁碱的抗血管形成作用:(1)用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和肿瘤细胞进行细胞毒实验(MTT比色法)，测试药物对细胞增殖的抑制作用和确定给药剂量;(2)采用体外内皮细胞迁移、黏附实验模型，体内动物模型——鸡胚绒毛尿囊膜法(CAM法)测试药物对活体血管增生的抑制作用;(3)芸香宁碱在非凋亡剂量时对肿瘤细胞培养上清液中VEGF蛋白分泌量的影响［14］。

1 材料与方法

1.1 材料 芸香宁碱 (批号:MFCD00102193)购自阿法埃莎中国化学有限公司;受精鸡蛋购自芜湖市钟氏禽业有限责任公司;脐静脉内皮细胞、人肺癌A549细胞株、人肝癌HepG2细胞株、人肠癌Lovo细胞株、人胃癌MKN-28细胞株、人乳癌MCF-7细胞株作为实验细胞株购于中山大学动物实验中心细胞库;四甲基偶氮唑盐(批号:206－069－5)购自阿拉丁试剂有限公司;VEGF－ELISA试剂盒(批号:kt039832)购自康肽生物(北京)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞增殖抑制试验(MTT比色法) 于对数生长期的人脐静脉内皮细胞和肿瘤细胞接种于96孔板中，接种密度约为每孔5 000个细胞。接种24 h后。将化合物(初始浓度为10 mmol·L－1)用培养基分别稀释至100、50、10、1 μmol·L－1。吸去 96孔板中的培养基，每孔加药100μL，各浓度平行设三个孔，并设空白孔(不加MTT显色)和对照孔(不加药物)，继续培养48 h。然后在每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μL，37℃ 继续培育4 h后，弃上培养基，每孔加入100μL DMSO，混匀振荡15 s使甲臢充分溶解。最后用酶标仪在492 nm处测定各孔OD值，记录结果。以细胞存活率对剂量作图求IC50值［15］。

结果计算:细胞存活率=(试验组细胞OD值－空白组细胞OD值)/(对照组细胞OD值－空白组细胞OD值)×100%。细胞抑制率=(1－细胞存活率)×100%。半数抑制浓度(IC50)即细胞抑制率为50%时药物的浓度。用药物的浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐标作图，可求出IC50值。

1.2.2 细胞迁移实验(刮除法) 参照洪敏等［16］的方法，HUEVCs长满单层后，0.25%的胰酶消化，调整细胞浓度为每毫升105个，在48孔细胞培养板加入内皮细胞2×104个，置于37℃、含有5%CO2的温箱中培养。细胞长满单层后，用灭菌后的移液枪枪头刮去一条直线。弃去培养基，PBS洗3次，每次100μL。将各化合物(初始浓度为10 mmol·L－1)用 DMEM 分别稀释至 30、15 μmol·L－1。每孔加药200μL，各浓度平行设三个孔。同时设置三个对照孔(即不加药物)，置于37℃培养箱继续培养12 h，弃去培养基，PBS洗3次。10倍倒置显微镜下拍照，计算内皮细胞由刮除边缘细胞向刮除区迁移到距离。

1.2.3 细胞黏附实验 鼠尾胶原蛋白 I型5 g·L－1用 0.006 mol·mL－1的无菌醋酸溶液稀释至0.012 g·L－1。取96孔细胞培养板，每孔加50 μL鼠尾胶原蛋白溶液(含2μg胶原蛋白)，并设空白(不加胶原蛋白)，超净台过夜晾干，用PBS洗3次后每孔加入0.2%的胎牛血清PBS溶液，放置37℃培养箱2 h以阻断非特异性结合位点。培养后，用PBS洗3次。每孔加入内皮细胞悬浮液50μL，同时加入50μL不同含浓度的化合物的培养基，设置阴性对照(加不含化合物的培养基50μL)，置于培养箱继续分别培养1 h和3 h。培养完毕后，PBS洗3次，除去未黏附细胞。黏附细胞用0.2%结晶紫染色10 min，冲洗，晾干。随后每孔加入2%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，在酶标仪570 nm测光密度OD值。每孔平行三次［17］。

结果计算:黏附率=(加化合物细胞OD值－空白组细胞OD值)/(阴性对照组细胞OD值－空白组细胞OD值)×100%，抑制率=(1－黏附率)×100%。

1.2.4 CAM 血管生成形态学检测 参考文献［18－19］所报道的方法制备CAM模型。具体方法:在孵化9 d的鸡胚气室端开一个1 cm×1 cm大小的正方形窗，暴露出尿囊膜，随后将已制备好的含30 g芸香宁碱的小纸片(5 mm)放在绒毛尿囊膜血管较少的部位，用灭菌透明胶带封窗后继续孵化。孵育3 d后将鸡蛋放入4℃冰箱冻存24 h。将冻存过的鸡蛋打在10 cm直径的细胞培养平皿，剥离CAM膜，以加药滤纸片为中心，剪取直径3 cm CAM，平铺于干净培养皿中，用数码相机拍照。照相后，用固定液(甲醇∶丙酮，1∶1)固定30 min以上，烘干保存。

1.2.5 人肝癌HepG2细胞培养上清液中VEGF的含量测定 HepG2细胞设3个复孔接种于24孔板，培养24 h后分别加入浓度分别为0、4、10、20μmol·L－1的芸香宁碱，随后继续培养24 h。分别收集各组上清液，按照VEGF-ELISA试剂盒操作要求操作，使用酶标仪在450 nm波长处测定样本的OD值。绘制标准曲线，计算上细胞上清液中VEGF的含量［20］。

2 实验结果

2.1 芸香宁碱对HUVEC细胞具有良好生的抑制作用 所有结果均重复3次，得出芸香宁碱对HUVEC、人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞、人肠癌Lovo细胞、人胃癌MKN-28细胞、人乳癌MCF-7细胞的半数抑制剂量分别为(33.2 ±0.4)、(93.8 ±0.1)、(41.6 ±0.3)、(50.8 ± 0.3)、(72.4 ± 0.5)μmol·L－1和 ＞100 μmol·L－1，说明芸香宁碱具有优先的抑制血管内皮细胞增殖的作用。同时证明芸香宁碱对于肿瘤细胞的增殖有一定的抑制能力。

2.2 芸香宁碱衍生物对内皮细胞迁移的抑制作用内皮细胞迁移功能在血管新生、伤口愈合、内皮损伤的愈合等过程中起着重要的作用。内皮细胞在长满单层在刮出一部分之后，刮出边缘的细胞将向刮除区迁移。实验中不同浓度的芸香宁碱与内皮细胞共同培养12 h后，内皮细胞向刮除区的迁移率明显与化合物浓度呈反比。15μmol·L－1和30 μmol·L－1时，芸香宁碱对内皮细胞的迁移如图2所示。在15 μmol·L－1和 30 μmol·L－1时迁移率分别为46.8%和27.4%。具有显著的内皮细胞迁移抑制作用。

2.3 芸香宁碱对内皮细胞细胞外基质黏附的抑制作用 芸香宁碱在与细胞共同作用1 h和3 h时能够有效的抑制内皮细胞在细胞外基质胶原蛋白上的黏附。当化合物浓度为15μmol·L－1和30μmol·L－1时的抑制率分别为41.7%和52.6%。

2.4 芸香宁碱对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用

芸香宁碱作用9日龄鸡胚尿囊膜72 h后，化合物均能不同程度的抑制鸡胚尿囊膜上血管生成。如图3所示，空白对照组的血管网分布均匀、粗大、形成多级分叉，而芸香宁碱组(30μg)在载样滤纸片周围血管网分布稀少、分叉程度较低，与沙利度胺组载体周围血管生长状态相似，显示出芸香宁碱经过载样滤纸片的缓慢释放后，形成了一个强烈抑制CAM血管生成的作用圈。另外，测试物滤纸片周围血管颜色鲜红，含血液，说明测试物没有毒死原有的血管，而是抑制了血管的新生。显示各芸香宁碱在30μg下即能显著抑制CAM血管的生成。

2.5 芸香宁碱抑制人肝癌HepG2细胞VEGF蛋白分泌 不同剂量芸香宁碱作用HepG2细胞24 h，测得 0、5、15、30 μmol·L－1各组培养上清液中VEGF 蛋白的含量分别为(401.3 ±21.7)、(354.2 ±24.1)、(309.7 ± 23.5)、(257.4 ± 20.3)μg·L－1。其中15 μmol·L－1和30 μmol·L－1剂量时培养上清液中的 VEGF含量分别比对照组下降22.8%和35.8%，分别P ＜0.05 和 P ＜0.01，差异具有显著性。

3 讨论

以通过抑制肿瘤血管新生而达到抑制肿瘤生长、扩散、浸润及转移的策略是近年肿瘤学领域研究的热点。目前对于肿瘤的发生、发展最主流的观点是癌基因激活、抑癌症基因失活、肿瘤新血管生成共同作用的结果。而血管生成是肿瘤生长和转移的条件，因为肿瘤的生长必须依靠新生血管提供氧气和养料。因此对于肿瘤新生血管有效的阻断作用既可以抑制肿瘤的生长又可以抑制肿瘤的转移。在早期，传统的抗肿瘤药物研究主要在肿瘤细胞生长的调控领域寻找作用靶点，因为组织细胞间的相似性使得这类抗肿瘤药物出现了选择性差、毒副作用大、耐药性易产生等缺点。因而结合传统的放疗、化疗治疗方法，通过抑制肿瘤新生血管生成可以减少传统药物的不良作用。故抑制血管生成可以作为抗肿瘤药物治疗新的靶点，具有成为癌症治疗的一个新的突破点的条件［2－4］。

本研究以血管生成作为靶点，在研究中我们发现芸香宁碱在高剂量时直接诱导肿瘤细胞的衰老凋亡，而在较低的非凋亡剂量时，能够优先抑制HUVEC的增殖、迁移和黏附作用，同时能够抑制肿瘤细胞分泌VEGF血管生长因子，从而表现出良好的抗血管生成作用。因此，芸香宁碱具备成为肿瘤血管新生抑制剂的几个条件:其一，差异细胞毒性，其杀伤或抑制HUVEC的药物剂量低于对肿瘤细胞的毒性剂量;其二，扰乱HUVEC的功能作用，即药物应该是在尚未引起内皮细胞死亡的情况下能够干扰内皮细胞的功能;其三，初步明确的抗血管生成的作用机制，我们的这一研究已初步明确了芸香宁碱抗血管生成的基本过程。因此，我们认为，芸香宁碱在体外具有明显抗血管生成效应。故本研究为芸香宁碱的作用机制为抗肿瘤药物的研发开启了一个新的视野，但在研究过程中仍有很多不清楚的因素，需要进一步深入的探讨。

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