HPLC-DAD法分析栝楼桂枝汤血中移行成分

向 青 ，许 文 ，刘 杰 ，张俊贤 ，陈 琳 ，陈娴雯 ，徐 伟 ，褚克丹

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122）

栝楼桂枝汤来源张仲景的《金匮要略》［1］，由天花粉、桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣6味药组成。临床上主要用于脑卒中后肢体痉挛及康复治疗［2-3］，并且药理研究表明栝楼桂枝汤具有良好的神经保护作用［4-8］。本研究采用HPLC-DAD全波长扫描法，通过对比栝楼桂枝汤原始方、栝楼桂枝汤灌胃给药大鼠后的含药血清及空白血清三者全波长扫描信息，分析复方血中移行成分，为揭示栝楼桂枝汤抗脑卒中后肢体痉挛与神经保护药效物质提供实验依据。

1 仪器与试药

日本岛津LC-20A高效液相色谱仪（包括LC-20A泵、DGU-20A3脱气机、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、M20A二极管阵列检测器和LC solution工作站）；5417R型小型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；KQ2200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WH-1型微型涡旋混合仪（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）；CPA225D型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；乙腈、甲醇、甲酸（德国Merck公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；其余试剂均为分析纯。

栝楼桂枝汤颗粒（福建省第二人民医院院内制剂）；没食子酸（中国药品生物制品检定所，批号：110831-200302）；肉桂酸（中国药品生物制品检定所，批号：110786-200503）；甘草酸（中国药品生物制品检定所，批号：110731-200615）；芹糖甘草苷（上海TAUTO公司，批号：12110622）；五没食子酰葡萄糖（上海TAUTO公司，批号：13102821）；芹糖异甘草苷（上海 TAUTO公司，批号：13061031）；芒柄花苷（上海 TAUTO公司，批号：13040722）；异甘草苷（上海 TAUTO 公司，批号：12111032）；甘草苷（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-120290）；甘草素（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-12022207）。以上标准品经面积归一法测定，纯度均大于98%。氧化芍药苷、芍药苷亚硫酸酯、苯甲酰芍药苷、芍药苷、芍药内酯苷为自行分离纯化，并经MS、NMR鉴定结构，HPLC-DAD检测，面积归一化法计算，纯度均大于98.5%。

动物：SPF级雄性SD大鼠6只，体质量（250±20）g，福建中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。

2 方法与结果

2.1 灌胃液的制备方法 取栝楼桂枝颗粒100 g，加入10倍量50%乙醇，加热回流提取2次，每次1 h，合并滤液减压蒸馏至无醇味，制得0.9 g／ml的栝楼桂枝汤提取液。根据临床用量换算成大鼠灌胃给药剂量为 3.6 g／（kg／d）。

2.2 实验动物及血清的采集方法 雄性SPF级SD 大鼠 6只，250 g左右，在温度（23±2）℃、湿度（55±10）%的动物房内饲养，每天接受12 h的光照自由饮食。将大鼠随机分成2组，每组3只，于给药前12 h禁食，可自由饮水。给药组按3.6 g／kg剂量连续灌胃3次，每次间隔1 h，给药栝楼桂枝汤提取液。空白组灌胃用等体积的蒸馏水，同样连续灌胃3次，每次间隔1 h。在腹主静脉收集最后一次灌胃后 10 min的全血，3000 r／min离心 10 min，取上清即得血清。

2.3 血清样本的前处理方法 合并给药血清，取2 mL，加入 4 倍量的甲醇，涡旋 2 min，12000 r／min离心10 min，取上清液室温下吹干，残渣用200 μL 50%甲醇复溶，12000 r／min离心 10 min，取上清进样10 μL进行HPLC-DAD分析。空白血清的处理同上。

2.4 色谱条件 色谱柱：Diamonsial C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脱程序：0～50 min 5%A～32%A，50～60 min 32%A～48%A；流速：0.8 ml／min；柱温：30℃；进样量：10 μL；DAD 全波长扫描范围：190～400 nm；液相色谱检测波长：254 nm。该色谱条件下所得栝楼桂枝汤原始复方图，灌胃给药血清图，空白血清DAD全波长扫描HPLC叠加对比图，如图1所示。

图1 HPLC-DAD各组色谱对比图

2.5 成分分析 ① 通过HPLC色谱叠加图对比，找出给药血清中保留时间上与原始复方重叠的色谱峰，从色谱上找出原始复方和给药血清24个共有峰，如图1所示。② 对各个共有色谱峰进行DAD全波长扫描图的提取，通过对比原始复方组、给药血清组、空白血清组三者全波长的信息来确认可能的入血移行成分。如果原始复方色谱峰的DAD扫描图和给药血清的扫描图特征一致，而相应保留时间处的空白血清没有该特征，那么就指认该成分可能为入血成分。以色谱峰5为例，如图2所示：原始复方和给药血清DAD全波长扫描图显示231 nm处有最大吸收波长，而相应保留时间处的空白没有该特征吸收，则认为该成分为入血移行成分；通过与标准品芍药苷比对，该峰保留时间和DAD光谱扫描图和标准品基本一致，故鉴定该入血成分为芍药苷，其他成分采用类似指认鉴定方法。此外，如果原始复方色谱峰的DAD扫描图和给药血清的扫描图特征一致情况下，而相应保留时间处的空白血清也显示该紫外特征，那么暂时不能认为该成分为入血成分。以23号峰为例，如图2所示：虽然该峰是原始复方和给药血清的共有峰，但是原始复方组、给药血清组、空白血清组三者DAD光谱特征均一致，该成分难以判定是否入血，可能是由于内源性物质不仅色谱上干扰，同时其光谱上也和原始方的成分存有类似结构。通过该方法共指认栝楼桂枝汤血中移行成分共22个（1～22号峰），采用标准品进一步比对鉴定其中16个。

图2 各组色谱峰5和23的DAD全波长扫描对比图

3 讨 论

3.1 给药方案考察 本研究前期比较了单次给药与连续灌胃给药对复方入血移行成分的影响，发现单次给药后不同时间点取血所得峰响应低，峰容量小，而用连续灌胃给药法（连续3次，每次间隔1 h）能显著提高复方入血程度及峰容量，可能原因是复方成分多而复杂，不同成分结构、极性等不同导致吸收存在差异，并且多成分间可能存在吸收拮抗或者协同作用，导致复方成分群吸收不一致。如果给药一次后某个时间点取血某些成分可能由于半衰期长还未吸收或者吸收弱导致未能检测出。同时复方吸收入血后的成分群其代谢消除速率不同，对于某些消除速率快的化合物，如果取血时间太久，其可能在体内已消除消失而影响检测。因此为了提高峰容量和峰响应，我们采用连续灌胃给药法测定栝楼桂枝汤血中移行成分获得满意效果。

3.2 血浆样品及色谱条件优化 本研究采用HPLC-DAD法研究复方血中移行成分，考虑复方血中移行成分浓度可能较低，为了能更好地分析血中移行成分，对比了不同分析取样量。结果表明含药血清取样量为2 mL时各个色谱峰检出良好，DAD全波长扫描光谱特征明显。同时为了提高色谱分离度，减小内源性物质的干扰从而增强DAD扫描光谱的比较，我们对色谱条件进行了优化：通过比较不同厂家色谱柱对栝楼桂枝汤的分离效果，最终选择色谱柱：Diamonsial C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相系统的选择，先后试用了5种流动相系统：乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.5%醋酸水，结果表明：使用乙腈体系流动相优于甲醇体系流动相，并且水相中加入0.1%甲酸有利于峰形的改善及色谱峰的分离，最终选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相系统。提取波长的选择：DAD全波长扫描，比较了 214、230、254、275、320、360 nm下原始复方组和给药血清组的对比图，发现254 nm下峰容量最多，并且囊括了其他色谱下的色谱重叠峰，最终采用254 nm作为叠加对比提取波长。

3.3 入血成分讨论 栝楼桂枝汤由天花粉、桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣6味药组成，本研究结果表明入血成分有22种，其中鉴定的没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷亚硫酸酯、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷来自白芍；芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、芒柄花苷、甘草素、异甘草素、甘草酸来自甘草；肉桂酸来自桂枝。这些成分可能是栝楼桂枝汤治疗脑卒中后肢体痉挛与神经保护的体内药效物质。

本研究采用HPLC-DAD全波长扫描法分析栝楼桂枝汤血中移行成分，指认了22个入血原型成分并经过标品比对鉴定了其中16个成分，提示它们可能对该复方发挥药效贡献较大。在后续研究中，为更好地阐明栝楼桂枝汤的体内药效物质，我们将进一步考察这些入血成分的生物活性。

（致谢：本研究在福建省中药产业技术开发基地、福建省中药学重点实验室平台、康复技术协同创新中心、国家中医药管理局中医康复研究中心资助下完成）

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［3］陈瑛玲，陈立典，陶静.栝楼桂枝汤治疗中风后肢体痉挛的临床研究［J］.中医临床研究，2013，5（4）：7-9.

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