紫杉醇酯质体不同条件下溶解效果的观察

刘东璐，黄战平

紫杉醇是从短叶红豆杉树皮中提取的天然产物，含氧四环紫杉烷环及酯侧链是抗肿瘤的有效成分，通过与细胞微管蛋白结合，使微管聚合抑制其解聚，使细胞有丝分裂受阻断，从而抑制肿瘤生长。临床主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌，联合用药时对小细胞肺癌、肝癌、胃癌也有明显活性［1］。尽管紫杉醇具有良好的抗肿瘤活性，但在水中溶解度仅＜0． 03 mg／mL，几乎不溶解于水，给静脉给药带来很大困难。有文献报道，紫杉醇在甲醇、乙醇、二甲亚砜等有机溶剂中可溶解［2］，但注射剂中表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油会引起过敏及心脏、神经、肾损害、血管毒性等不良反应［3，4］。新药物转运系统酯质体自20世纪90年代在国内研发紫杉醇，不仅解决了水溶性问题，又提高了药物靶向性和减轻变态反应，发挥抗肿瘤活性。但酯质体本身存在较高的药物泄漏率、稳定性差、长期保存困难等缺点，尤其国内注射用紫杉醇酯质体，应用时按要求加5%葡萄糖溶液10mL在漩涡专用电子振荡器上振荡5min，致完全溶解转移液体可为病人静脉输注。但经多次临床观察，此方式配制的液体输注中多次发现分层、颗粒物聚集或沉淀等现象，继而弃之造成药物浪费。经分析：由于目前该药多为冻干块状物，加入溶媒葡萄糖时，葡萄糖黏度大，溶解时药物再分散性较差，很难在较短时间内得到均匀一致的药物混悬液；且因包封剂型，溶解时溶剂量过少，长时间振荡也不能完全溶解，甚至破坏包封效果致药物泄露，而溶剂量过多振荡时药液会从穿刺针眼处外溢造成污染；此外，药物在水溶液中多以混悬液形式存在，不透明，难以肉眼辨清药物颗粒的完全溶解情况，且在目前多数医院未实行集中配制，配药人员多无药学背景，操作者水平参差不齐，常误将一些未完全溶解的药物颗粒加入输液中导致成品液体不稳定。本研究为保证病人用药安全，结合说明书的配制要求和临床使用中的问题，进行配制过程中新的药物溶解剂量和振荡时间的实验研究，拟为临床合理配制提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 药品与溶剂 注射用紫杉醇酯质体150支（30 mg／支，南京思科药业公司生产，批号为114040309；5%葡萄糖500mL（石家庄四药生产，批号为1311261603－A）；重蒸馏水；磷酸缓冲液（PBS）；0．9%氯化钠溶液。

1．1．2 仪器与器材 LabAlliance高效液相色谱仪1台（安捷伦液相色谱科技公司生产），Mastersizer 2000－激光粒子测定仪1台（英国马尔文公司生产），20mL、1 mL一次性注射器（山东威高医用有限公司生产），玻璃试管数个，漩涡电子振荡器3台（频率 3000r／min，振幅：X轴方向7cm，Y轴方向7cm，Z轴方向4cm，扬州宝军电子机械有限公司生产）。

1．2 方法

1．2．1 配药环境 均在静脉配制中心百级生物安全柜内配制，护士带帽子、口罩、无粉手套及防护服，严格执行无菌技术，溶媒液体中的微粒数符合2010版中国药典控制指标。

1．2．2 分组 首先将注射用紫杉醇酯质体150支进行编号并分为3组，每组50支。

1．2．3 配伍溶液制备 在相同环境、温度下，由动作规范、操作熟练的同一护士配制药物。各药瓶启盖消毒后用20mL注射器抽取5%葡萄糖溶液沿小瓶内贴壁缓慢注入，回抽空气5mL。A组每瓶注入10mL，B组注入15mL，C组注入20mL，同时放在3个专用电子振荡器上震荡并计时，计时从液体瓶放到振荡器振荡之时开始，分别振荡5min、10min、15min、20min时取出，静止5min。

1．2．4 药物稳定性检验方法

1．2．4．1 药物粒径测定 用1mL注射器抽取制备后的紫杉醇酯质体混悬液1．0mL，分别注入备用的玻璃试管中，以水为分散介质，稀释约20倍后，用激光粒度测定仪测定每支玻璃试管溶液中不同大小直径的药物微粒数，由此得出一次实验结果，以上法每个时点平行测定50次（n＝50，即每次测定都是同一批号溶媒和药物），得出3组药物在不同振荡时间点药液中不同粒径微粒数目。

1．2．4．2 药物包封率测定 利用含药酯质体破乳溶液进行稳定性考察，用1mL注射器抽取紫杉醇酯质体混悬液1mL于葡聚糖凝胶（SephadexG－50）柱分离，先用30mL磷酸缓冲液洗脱液进行洗脱，取前15 mL洗脱液测定紫杉醇含量为包封药物总量，再用0．9%氯化钠溶液10mL洗脱剩余游离药物。另取紫杉醇酯质体混悬液1mL，测定其中紫杉醇含量为包封和未包封药物总量。包封率按以下公式计算：包封率（%）＝脂质体中包封的药物／总药物量×100%。

1．2．5 评价标准 酯质体是一个发展中的新剂型，其质量评定标准尚在逐步完善之中，《中国药典》2000年版（二部）增加了对酯质体制剂的指导原则，包括有害有机溶剂限度检查，形态、粒径及其分布检查，载药量或包封率的检查等［5］。《中国药典》自2005年版起附录中注射剂不溶性微粒检查方法中均新增加了光阻法，并注明本方法适用于混悬液和易析出微粒的注射剂，如乳状液、胶体溶液等。与显微镜计数法比较，光阻法具有操作简便、直接检查、快速得出结果等优点。本研究采用激光粒度测定仪光阻法测定各组每毫升混悬液中紫杉醇酯质体不同粒径数。同时，包封率是评价酯质体制剂质量好坏最重要指标，也是酯质体能否发挥较普通制剂高效、低毒特点的关键，测定包封率关键是把未包封游离药物从脂质体上分离出来，常用分离方法有柱层析法、透析法、超速离心法、超滤膜过滤法等［6－8］。《中国药典》2005年版（二部）附录微囊、微球及酯质体制剂指导原则中质量检查项目规定：若得到的是分散在液体介质中的微囊、微球、脂质体，应通过适当方法（如凝胶柱色谱法、离心法或透析法）进行分离后测定，按下式计算包封率［包封率（%）＝（系统中包封与未包封的总药量－液体介质中未包封的药量）／系统中包封与未包封的总药量×100%］，包封率不得小于80%［9］。因此，本研究利用含药酯质体破乳溶液采用凝胶柱色谱法计算各组每毫升混悬液中紫杉醇酯质体药物包封率。

1．2．6 统计学方法 数据用SPSS13．0软件包进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，组间比较用F检验，以P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果（见表1、表2）

表1 不同振摇时间对紫杉醇脂质体粒径的影响（±s） nm

表1 不同振摇时间对紫杉醇脂质体粒径的影响（±s） nm

5min 10min 15min 20min A组 50 979．16±11．25 958．25±10．78 921．17±10．23 9组别 支数0． 011）与 A组、C组比较，P＜0．01；2）与本组5min、10min比较，P＜0．01。20．13±10．08 B组 50 853．25±10．161） 821．03±10．031） 803．11±9．051）2） 802．79±9．031）2）C组 50 963．12±11．21 948．21±10．33 917．11±10．01 909．13±10．02 P＜0．01 ＜0．01 ＜0．01 ＜

表2 不同振摇时间对紫杉醇酯质体包封率的影响（±s） %

表2 不同振摇时间对紫杉醇酯质体包封率的影响（±s） %

5min 10min 15min 20min A组 50 98．29±0．13 96．25±0．09 94．37±0．07 82．02±0．011）组别 例数0． 011）与本组5min、10min、15min比较，P＜0．01。B组 50 99．87±0．25 98．93±0．23 96．22±0．19 83．63±0．071）C组 50 99．12±1．21 98．21±1．33 96．89±1．01 84．13±1．021）P＜0．01 ＜0．01 ＜0．01 ＜

3 讨论

作为类脂双分子层、结构类似生物膜药物载体酯质体，具有使药物缓控释、降低不良反应、提高治疗效果靶向性等优点，载入药物后不仅提高药物稳定性，又解决了难溶性药物的给药问题。但酯质体膜结构——磷脂分子间是靠范德华力、氢键、疏水等而相互作用，在外界不稳定因素作用下磷脂分子间不断交换位置，可自发聚集、沉淀造成形态、结构不稳定，尤其注射用紫杉醇酯质体以冻干形式存在虽有较好稳定性［10］，但对其混悬液而言，更易受缓冲液pH值、离子强度、温度及脂质体类脂表面电荷、粒径等因素影响而破坏膜结构［11］，溶解时不合理的溶解分散会破坏膜结构，使脂质体颗粒发生聚集、降解、变性、沉降等不稳定现象，且其粒径大小和粒度分布均匀程度也会直接影响药物在机体组织内的作用［12］。因此，制备紫杉醇酯质体成品输液时，应严格控制药物脂质体粒径和包封率大小，使其尽量符合国家药典规定指标，保证药效［13］。本研究针对该药缓冲液溶媒葡萄糖黏度大，溶解时使粉剂再分散性较差，很难在较短时间内得到均匀一致酯质体混悬液，溶解时常借助专用电子振荡器经一定振荡时间振摇助溶而完全溶解。由于药物酯质体块状物在不同剂量溶媒中溶解分散时，剂量不同、振荡时间不同振摇时使药物颗粒表面所受外力会不同，从而影响药物溶解效果。在此理论基础上结合临床观察多次发现成品液体不稳定现象，进一步展开该药配制时溶解剂量和振荡时间实验研究，为合理用药提供依据。

3．1 溶媒剂量的影响 本研究以说明书加入溶媒剂量10mL和实际观察该药瓶最大溶媒剂量为22mL为参考，观察3种不同剂量。结果显示：不同溶媒剂量下该药物经不同振摇时间制得药物混悬液，采用激光粒度仪测定药物粒径，在其他条件相同情况下通过50个批次平行考察发现，不同溶媒剂量对混悬液中药物粒径有明显影响。B组采用15mL溶媒剂量制备药物混悬液，不同振摇时间药物粒径较A组、C组小，说明了Stokes方程酯质体粒径越小越稳定的研究。经分析：该药物在10mL溶媒剂量时借助漩涡专用电子振荡器最大振幅7mm，振荡频率 3000r／min振摇助溶下，由于溶媒量少，药物块状物在一定溶液中分散空间小不宜分散；20mL溶媒量时由于该药瓶的最大容积为22mL，溶媒加入后，药瓶中空余空间小，振摇时溶媒与瓶体一起旋转，甚至不存在相对旋转，药物颗粒表面受外作用力小，形成药物颗粒与颗粒、颗粒与溶媒间相互结合力相对较大，不易使颗粒分散，故而形成较大粒径酯质体颗粒，导致成品液体中颗粒物聚集、沉淀或分层不稳定性现象。而加入15mL溶媒振摇时药物块状物在溶媒中，随振荡器摆动自由运动，在相同振摇时间下药物颗粒较易分散，颗粒粒径较小致完全溶解，呈均匀分布不易引起聚集、沉淀或分层等不稳定现象。因此，紫杉醇酯质体药物在水溶液中振摇溶解时应加入15mL溶剂量，其物理稳定性指标才更可靠。

3．2 振摇时间的影响 包封率是评价酯质体制剂质量最重要指标，也是酯质体能否发挥较普通制剂高效、低毒特点的关键。《中国药典》2005版质量检查指导原则中规定：包绕后的未溶解药物脂质体粒径在300 nm以下，而分散在液体介质中酯质体，包封率不得小于80%［9］。由于药物酯质体本身包封剂型特点，在一定量液体介质中借助振荡器一定的震荡幅度和频率分散时，其分散效果也与振荡时间密切相关。本研究参照说明书中振摇时间为5min和肉眼观察药物完全溶解所需振摇时间为20min为参考，严密观察分别在振摇5min、10min、15min、20min时混悬液中药物粒径和包封率的变化。结果显示：B组溶媒剂量下当振摇时间从5min增加到20min时，药物粒径从853．25 nm减少到了802．79nm，可见随着振摇时间的延长混悬液中药物粒径会逐渐减小。在振摇15min与20 min时粒径变化不大，但15min与5min、10min两个时间点粒径比较差异有统计学意义（P＜0．01），因此应振摇15min。表2结果显示：不同溶媒剂量下该药物经不同振摇时间制得混悬液，采用高效液相色谱仪测定药物包封率，在其他条件相同情况下通过50个批次平行考察发现，不同振荡时间对混悬液中药物包封率有明显影响。首先3组不同剂量下随着振荡时间延长药物包封率均在80%以上，符合国家药典规定要求。其次，3组随着振荡时间延长药物包封率均降低，特别是当振摇增加到20min时有明显下降，与其他各时间点相比差异统计学意义（P＜0．01），因此不应过分延长振荡时间。经分析：制备紫杉醇酯质体成品输液时，在专用振荡器振摇助溶下，颗粒在一定时间内经过X轴、Y轴、Z轴方向形成漩涡式同方向分散，颗粒与颗粒间碰撞力、颗粒与溶媒间剪切力保持同向，不易破坏颗粒表面间稳定作用力，使颗粒表面双层膜保证完整，使紫杉醇不易外渗提高了包封率，但振摇时间延长可能会破坏颗粒表面间稳定作用力，使颗粒表面双层膜破坏，使包封率下降。因此振荡时间不应大于15 min。结果显示，15min振荡时间药液中粒径最小，药液最稳定，因此综合分析更应以15min为最佳振荡时间。

总之，针对目前脂质体作为紫杉醇水溶性药物的新型载体，由于脂质体本身和该药包绕剂型特点，使紫杉醇酯质体冻干块状物在水溶液中通过振荡溶解制备成品输液时，易受溶媒量和震荡时间等因素影响而使药物溶解不全或破坏膜完整性，导致脂质体聚集、沉降、药物渗漏和分层。本研究针对该药目前形式配制下临床应用中成品输液的不稳定现象，考察了在注入10mL、15mL、20mL 3种不同溶媒剂量下，分别在振摇5min、10min、15min、20min以包封率、粒径2个重要特征为评价指标，分析药物脂质体混悬液中经专用振荡器振荡溶解下的稳定性变化。结果配制该药物时应注入15mL溶媒，振摇15min混悬液中药物稳定性指标最可靠。由此充分了解该药的溶解与溶剂量的配比关系和恰当振摇时间，有助于减少药物不良事件的发生，提高用药安全性。

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